книжный портал
  к н и ж н ы й   п о р т а л
ЖАНРЫ
КНИГИ ПО ГОДАМ
КНИГИ ПО ИЗДАТЕЛЯМ
правообладателям

Дженнифер Даудна, Сэмюел Стернберг;Пер. САнгл. С.

Трещина в мироздании

Редактирование генома: невероятная технология, способная управлять эволюцией

Нашим родителям, Дороти и Мартину Даудна (Дж. Д.)

и Сюзанне Ниммрихтер и Роберту Стернбергу (С. С.)

Наука не представляет себе глубины собственного воображения. Ральф Уолдо Эмерсон

Пролог

Волна

Мне снится, что я стою на берегу моря.

По обе стороны от меня длинная полоса светлого песка с вкраплениями темных песчинок простирается вдоль воды, очерчивая большую бухту. Я осознаю, что это берег гавайского острова, на котором я выросла, – край бухты Хило, где я когда-то проводила выходные с друзьями, наблюдая за соревнованиями по гребле на каноэ или разыскивая ракушки и стеклянные шары, упавшие за борт с японских рыболовецких судов и иногда выносившиеся на берег волнами[1].

Но сегодня тут не видно ни друзей, ни каноэ, ни рыболовецких суденышек. Берег пуст, песок и вода неестественно спокойны. За волнорезом лучи света нежно играют на поверхности океана, будто хотят унять мой страх, зародившийся еще в детстве, – страх, преследующий каждого жителя города Хило независимо от его возраста. Пока я была ребенком, на остров ни разу не приходили волны цунами, но все мы видели фотографии. Мы знаем, что город находится в зоне затопления.

Как по заказу, вдалеке появляется она. Волна.

Сначала она совсем небольшая, но с каждой секундой растет, возвышается передо мной стеной, ее пенистые гребни заслоняют небо. За ней – другие волны, и все они катятся по направлению к берегу.

Я скована страхом – но, когда цунами подходит ближе, ужас уступает место решимости. Позади себя я замечаю небольшую деревянную хибарку. Она принадлежит моей подруге Пуа, и перед ней валяется множество досок для серфинга. Я хватаю одну из них и плюхаюсь в воду, выгребаю в бухту, огибаю волнорез и направляюсь прямо в набегающие волны. Я успеваю поднырнуть под первую из них до того, как она настигнет меня, и, оказавшись по другую сторону от нее, скатываюсь по второй волне. В эти мгновения я наслаждаюсь открывшимся видом. Он прекрасен: гора Мауна-Кеа, а за ней – Мауна-Лоа, устремляются ввысь, в небо, защитными стенами возвышаясь над бухтой.

Я зажмуриваюсь – и открываю глаза в своей спальне в Беркли, штат Калифорния, за тысячи миль от дома, в котором выросла.

Сейчас июль 2015-го, и это самый захватывающий, самый ошеломительный год моей жизни. Я уже давно вижу подобные сны, но теперь мне легко распознать их глубинный смысл: берег – это мираж, но волны и клубок эмоций, которые они вызывают – страх, надежда, трепет, – чрезвычайно реалистичны.

Меня зовут Дженнифер Даудна. Я биохимик, и большую часть своей карьеры я провела в лаборатории, исследуя вещи, о которых большинство неспециалистов ничего не слышали. Однако в последние лет пять я оказалась вовлечена в работу, которую можно считать подлинным прорывом в науках о жизни, и теперь их развитие невозможно удержать в стенах какого бы то ни было исследовательского центра. Меня и моих коллег захватила непреодолимая сила, мало чем отличающаяся от цунами моих снов – с той лишь разницей, что в реальности эти волны помогла вызвать я сама.

К лету 2015-го года биотехнологический метод, который я помогла разработать всего за несколько лет до этого, набрал в своем развитии такую скорость, какую я и представить себе не могла. И возможные последствия его применения обретают подлинно сейсмический масштаб – не только для медико-биологических наук, но и для жизни на Земле в целом.

Эта книга – история развития этого метода и моя собственная история. И ваша тоже. Пройдет не так много времени, прежде чем плоды, которые принесет новая технология, окажутся и у вас на пороге.

Люди тысячелетиями изменяли окружающий мир ради своих целей, но результаты их деятельности никогда не были настолько масштабными, как сейчас. Промышленная революция вызвала изменения климата, угрожающие экосистемам по всему земному шару, и она же вместе с другими формами человеческой деятельности стала предпосылкой резкого ускорения вымирания видов, в ходе которого исчезает множество популяций самых различных существ – наших соседей по планете. Эти перемены побудили геологов предложить новое название для эпохи, в которую мы живем, – антропоцен, эра человека.

В биологическом мире тоже происходят кардинальные перемены, вызванные человеческой деятельностью. В течение миллиардов лет жизненные формы усложнялись согласно закономерностям, которые выявил Дарвин: организмы совершенствовались благодаря череде случайных генетических изменений, часть которых обеспечивала преимущества для выживания, конкуренции и размножения. До сих пор и наш собственный вид формировался под действием аналогичного процесса; несомненно, вплоть до недавнего времени мы во многом зависели от его милости. Десять тысяч лет назад, когда возникло сельское хозяйство, люди начали сами влиять на эволюцию путем селекции растений и животных, однако исходный материал – случайные мутации в ДНК, лежащие в основе доступных генетических вариаций, – все еще появлялся самопроизвольно и бессистемно. Поэтому попытки нашего вида преобразовать природу были трудными и имели ограниченный успех.

Теперь все кардинально переменилось. Ученые сумели полностью взять этот древний процесс под контроль человека. Используя мощные биотехнологические инструменты для экспериментов с ДНК внутри живых клеток, они теперь могут манипулировать составом этой молекулы и рационально изменять гены, определяющие облик любого биологического вида на планете, включая и наш с вами. А с появлением новейшего и, вероятно, самого эффективного инструмента генной инженерии, CRISPR-Cas9 (коротко – CRISPR), геном – всю ДНК организма, включающую каждый его ген, – стало почти так же просто редактировать, как обычный текст.

Зная, чем именно кодируется в геноме тот или иной конкретный признак, ученые могут использовать CRISPR, чтобы вставить, отредактировать или удалить связанный с ним ген у фактически любого растения или животного. Этот способ гораздо проще и эффективнее, чем любая другая существующая технология манипуляции генами. Буквально в одночасье мы оказались на пороге новой эпохи генной инженерии и нового уровня владения биологией – революционной эры, в которой возможности ограничены только коллективным воображением человечества.

Царство животных было первой экспериментальной площадкой для испытаний этого нового средства редактирования генов – и до сих пор остается самой большой из таких площадок. К примеру, ученые использовали CRISPR для создания генетически “усиленной” версии биглей, в результате чего получились собаки с мускулатурой, которой позавидует сам Шварцнеггер, – и для этого понадобилось всего лишь поменять одну “букву” ДНК в гене, контролирующем развитие мышц. В другом случае, “выключив” у свиней ген, отвечающий на сигналы гормона роста, исследователи создали микропигов – свиней размером не больше упитанной кошки, ставших популярными домашними животными. Ученые из китайской провинции Шэньси проделали нечто подобное и с мясо-шерстными кашемировыми козами, отредактировав геном этих животных таким образом, чтобы у них вырастали и более крупные мышцы (и за счет этого они давали больше мяса), и более длинная шерсть (что означает получение большего количества кашемировых волокон). Генетики даже используют CRISPR для превращения ДНК азиатского слона в максимальное подобие ДНК шерстистого мамонта, надеясь когда-нибудь воскресить этого вымершего доисторического зверя[2].

Параллельно с этим в экспериментах с растениями CRISPR широко используется для редактирования геномов сельскохозяйственных культур; это открывает перспективы для кардинального улучшения питания людей во всем мире и повышает уровень мировой продовольственной безопасности. Эксперименты по редактированию генома дали устойчивый к различным болезням рис, томаты, которые теперь портятся гораздо медленнее, соевые бобы с более полезным для здоровья содержанием полиненасыщенных жиров и картофель с меньшим количеством сильного нейротоксина. Причем специалисты в области пищевой промышленности достигают подобных улучшений не с помощью трансгенных технологий – то есть вставки участка ДНК одного вида в геном представителя другого вида, – но благодаря точно подобранным улучшениям генов, затрагивающим всего несколько “букв” собственной ДНК организма.

Но хотя потенциальные возможности применения CRISPR в растительном и животном мире весьма впечатляют, все же наибольшие перспективы сулит редактирование генов нашего собственного вида – и оно же, по мнению многих, представляет наибольшую угрозу для будущего всего человечества.

При этом, как ни парадоксально, ряд преимуществ в области здравоохранения, скорее всего, будет получен в результате CRISPR-экспериментов с позвоночными или даже насекомыми. В проведенных недавно экспериментах технологию CRISPR использовали, чтобы “гуманизировать” ДНК свиней, что дает надежду на то, что эти животные однажды послужат донорами органов для людей. CRISPR также удалось запрятать в геномы новых линий комаров: ученые надеются, что внедрение новых признаков в дикие популяции комаров поможет в конечном счете уничтожить заболевания, передаваемые ими – такие как малярия и лихорадка Зика, – или даже полностью истребить самих комаров – переносчиков болезней.

Впрочем, при лечении многих болезней CRISPR потенциально можно будет применять для редактирования и “ремонта” генов самих пациентов. Пока что мы наблюдали лишь малую часть возможностей технологии, но и то, что мы увидели в последние несколько лет, кажется головокружительным. В человеческих клетках, выращенных в лаборатории, эта новая технология редактирования генома уже была использована, чтобы исправить мутации, ответственные за муковисцидоз, серповидноклеточную анемию, некоторые формы слепоты, тяжелый комбинированный иммунодефицит и многие другие недуги. CRISPR дает ученым возможность решать такие задачи, находя и исправляя отдельные “опечатки” в молекулах, составляющих геном длиной 3,2 миллиарда “букв” ДНК, но эту же технологию можно использовать и для значительно более сложных модификаций. Исследователи поправили ошибки в ДНК, вызывающие мышечную дистрофию Дюшенна, вырезав только поврежденный участок мутировавшего гена и не затронув остальную его часть. В случае гемофилии А биологи применили CRISPR, чтобы точно переставить более полумиллиона “букв” ДНК, которые в геномах больных инвертированы – то есть расположены в порядке, обратном нормальному. CRISPR можно использовать даже для лечения ВИЧ-инфекции и СПИДа – либо путем вырезания ДНК вируса из инфицированных клеток пациента, либо путем редактирования ДНК самого пациента таким образом, чтобы его клетки невозможно было заразить ВИЧ.

Список потенциальных терапевтических применений редактирования генома можно продолжать бесконечно. Поскольку CRISPR обеспечивает точное и сравнительно простое редактирование ДНК, он превратил все генетические заболевания – по крайней мере, те из них, для которых известны вызывающие их мутации, – в потенциально излечимые. Медики уже начали бороться с некоторыми видами рака с помощью усовершенствованных иммунных клеток, чьи геномы “усилены” отредактированными генами, помогающими клеткам-хозяевам отлавливать раковые клетки. Хотя пройдет еще немало времени, прежде чем основанные на CRISPR варианты терапии станут общедоступны для пациентов, их потенциал четко виден уже сейчас. Редактирование генома дает надежду на то, что у нас появятся новые методы лечения, меняющие жизнь пациента, а в ряде случаев способные даже спасти ее.

Существуют и другие перспективы применения технологии CRISPR: ее можно использовать не только для лечения заболеваний, но и для их профилактики в будущих поколениях. Метод CRISPR настолько прост и эффективен, что ученые смогут использовать его для модификации человеческих клеток зародышевого пути – потока генетической информации, соединяющего одно поколение с другим. И, несомненно, эта технология – когда-нибудь, где-нибудь – будет использована для наследуемых изменений генома нашего вида, и это навсегда изменит генетическую картину человечества.

Если предположить, что безопасность и эффективность технологии редактирования генов человека будут доказаны, кажется логичным и даже предпочтительным исправлять болезнетворные мутации на самых ранних стадиях развития – до того, как опасные гены причинят вред своему обладателю. Но как только мы научимся превращать мутировавшие гены эмбриона в нормальные, появится искушение улучшить нормальные гены до предположительно более “продвинутых” версий. Должны ли мы начать редактировать геном еще не рожденного ребенка, чтобы снизить риск того, что у него когда-нибудь разовьются болезни сердца, болезнь Альцгеймера, диабет или рак? А можно ли наделять этих детей полезными признаками, такими как повышенная сила мышц или улучшенные умственные способности? Можно ли менять их внешний вид – скажем, цвет глаз и волос? Стремление к совершенству кажется едва ли не вшитым в природу человека, но, если мы все же пойдем по этой скользкой дорожке, нам может не понравиться то, куда она нас приведет.

Проблема вот в чем. В течение примерно сотни тысяч лет[3] существования людей современного типа геном Homo sapiens формировался под одновременным действием двух сил – случайных мутаций и естественного отбора. А теперь – впервые в истории – мы получили возможность редактировать не только ДНК ныне живущих людей, но и ДНК будущих поколений – по сути, направлять эволюцию собственного вида. Это беспрецедентный случай в истории жизни на Земле. Он лежит за пределами нашего понимания. И это ставит перед нами невероятный, но жизненно важный вопрос: как мы, представители капризного вида, неспособные договориться друг с другом столь о многих вещах, посчитаем возможным распорядиться этой грандиозной силой?

Контроль над эволюцией человеческого вида – это было последнее, что могло бы прийти мне в голову в 2012 году, когда мы с коллегами опубликовали статью об основах технологии редактирования генома CRISPR. Начать это исследование нас побудил интерес к совершенно другой области биологии – к механизмам, с помощью которых бактерии защищаются от заражения вирусами. Однако в ходе нашего исследования иммунной системы бактерий, названной CRISPR-Cas, мы раскрыли механизмы работы невероятной молекулярной машины, способной с непревзойденной точностью разрезать на части вирусную ДНК. Возможность применения той же машины для проведения манипуляций над ДНК в клетках других организмов, включая человека, сразу стала нам очевидна. И когда эта технология получила широкую известность и стала распространяться, я не могла не погрузиться в детали многочисленных исследований, основанных на результатах той нашей работы.

Когда ученые использовали CRISPR в экспериментах с эмбрионами приматов для создания первых обезьян с отредактированными генами, я задавалась вопросом, сколько времени пройдет, прежде чем какие-нибудь ученые-бунтари попытаются проделать то же самое с людьми. Поскольку я биохимик, мне никогда до этого не приходилось работать с модельными животными[4], с человеческими тканями и уж тем более с пациентами-людьми; привычная мне экспериментальная обстановка была ограничена чашками Петри и пробирками, которые использовали сотрудники моей лаборатории. Но теперь я своими глазами видела, как технологию, которую я помогла создать, применяют в исследованиях, способных радикально изменить и наш вид, и мир, в котором мы живем. А вдруг мы, сами того не желая, усугубим социальное или генетическое неравенство или запустим новую волну евгеники? К каким последствиям применения CRISPR нам готовиться?

Меня подмывало оставить эти рассуждения тем, кто специализируется на проблемах биоэтики, и вернуться к воодушевляющим биохимическим исследованиям, которые и вывели меня на CRISPR. Но в то же время как первопроходец в этой области я чувствовала, что обязана принять участие в дискуссии о том, каким образом могут и должны быть использованы технологии, основанные на CRISPR. В частности, мне хотелось убедиться, что в обсуждениях участвуют не только исследователи и специалисты по биоэтике, но и самые различные группы заинтересованных лиц, в том числе социологи, политические деятели, представители духовенства, законодатели и рядовые граждане. Учитывая, что научный прогресс оказывает влияние на все человечество, я считала своим долгом привлечь к дискуссии как можно больше участников из самых разных частей общества. Более того, мне казалось, что разговор следует начать немедленно, до того как новые случаи применения технологии сведут на нет любые попытки управлять ее развитием.

Поэтому в 2015 году, когда я руководила собственной лабораторией в Беркли и ездила по миру, представляя на семинарах и конференциях результаты своих исследований, я начала посвящать все больше времени вещам, до тех пор для меня совершенно несвойственным. Я отвечала на десятки вопросов репортеров обо всем – начиная с “дизайнерских детей” и гибридов свиньи и человека и заканчивая генетически модифицированными “сверхлюдьми”. Я разговаривала о CRISPR с губернатором штата Калифорния, с членами Управления по научно-технической политике Белого дома, с ЦРУ и даже выступала в Конгрессе США. Я организовала первую встречу для обсуждения этических вопросов, которые ставит техника редактирования генома, в особенности CRISPR, в самых разных областях – от репродуктивной биологии и генетики человека до сельского хозяйства, защиты окружающей среды и общественного здравоохранения. И, вдохновившись этой первой встречей, я помогла организовать гораздо более крупный Международный саммит по вопросам редактирования генома человека, собравший ученых и представителей других профессий из Соединенных Штатов, Великобритании, Китая и всего мира.

Во всех обсуждениях мы вновь и вновь возвращались к вопросу о том, каким образом нам следует управлять всей мощью новой технологии редактирования генома. Мы пока не нашли ответ, но шаг за шагом подбираемся к нему.

Редактирование генома вынуждает нас разобраться в непростой задаче: где провести этические границы при манипуляциях человеческими генами. Некоторые люди считают любое воздействие на гены мерзким и извращенным попранием священных законов природы и величия жизни. Другие воспринимают геном просто как программное обеспечение – нечто такое, что мы вполне можем исправить, почистить, обновить и улучшить; сторонники этой точки зрения полагают, что оставлять людей, которым можно помочь, заложниками ошибок в их генах – не только иррационально, но и аморально. Рассуждения такого толка побудили одних участников дискуссии требовать полного запрета редактирования генома еще не рожденных детей, в то время как их оппоненты призывают разрешить ученым проводить любые манипуляции с генами без всяких ограничений.

Мои собственные взгляды на проблему меняются (в том числе и в настоящее время), но меня поразил комментарий, сделанный в январе 2015 года на конференции, которую я организовала для обсуждения проблем редактирования генов в человеческих клетках зародышевого пути. Семнадцать человек, включая соавтора этой книги (и по совместительству моего бывшего аспиранта) Сэма Стернберга, сидели за столом для совещаний в калифорнийской долине Напа и вели жаркий спор о том, будет ли разрешено редактировать клетки зародышевого пути, и если да, то когда это случится. Внезапно кто-то придвинулся ближе к столу и очень тихо сказал: “Наступит время, когда неэтичным будет не воспользоваться редактированием генов эмбриональных клеток ради того, чтобы облегчить страдания человека”. Эта реплика кардинально поменяла ход нашей дискуссии, и она каждый раз всплывает у меня в памяти, когда я встречаюсь с родителями или будущими родителями, столкнувшимися с разрушительными последствиями генетических заболеваний.

Пока мы рассуждаем, исследования CRISPR продвигаются вперед. В середине 2015 года китайские ученые опубликовали результаты эксперимента, в котором они вводили CRISPR в человеческие эмбрионы. Исследователи использовали отбракованные, нежизнеспособные эмбрионы, но их исследование тем не менее стало важной вехой: впервые была сделана попытка прицельно отредактировать ДНК эмбриональных клеток человека.

Достижения подобного рода вызывают вполне оправданную тревогу. Однако мы не можем не заметить и фантастических возможностей, которые редактирование генома открывает для помощи людям, страдающим от инвалидизирующих наследственных заболеваний. Представьте себе, что человек, узнавший, что несет в себе мутантную копию гена HTT[5] (а это почти наверняка означает раннее наступление деменции), получит доступ к основанному на CRISPR лекарству, способному устранить мутацию еще до проявления каких-либо симптомов заболевания. Никогда раньше мы не были так близки к созданию методов излечения наследственных заболеваний, и важно, чтобы, пока идут споры по поводу редактирования геномов человеческих клеток зародышевого пути, мы не настроили общественность против CRISPR и не затруднили внедрение технологии в клиническую работу для лечения недугов, не передающихся по наследству.

У меня вызывают невероятный энтузиазм возможности, которые сулит нам редактирование генома. Исследования CRISPR – и те, что ведутся в научных лабораториях, и те, что проходят в биотехнологических стартапах (а последние уже получили более миллиарда долларов от венчурных инвесторов), – быстро приносят новые данные. Подстегивая развитие отрасли, научные работники и некоммерческие организации предлагают недорогие инструменты, основанные на CRISPR, ученым со всего мира, и таким образом исследования можно вести непрерывно и беспрепятственно.

Однако научный прогресс нуждается не только в исследованиях, инвестициях и инновациях: не менее важно участие общественности. До нынешнего времени революция CRISPR проходила по большей части за закрытыми дверьми лабораторий и биотехнологических стартапов. Изданием этой книги и рядом других действий мы надеемся вытащить эту революцию на всеобщее обозрение.

В первой части этой книги, которая называется “Инструмент”, мы с Сэмом рассказываем захватывающую предысторию технологии CRISPR: как она начиналась с исследований иммунной системы бактерий и какие преимущества получила в результате десятилетних разработок методов переписывания ДНК внутри клеток. Во второй части – “Задача” – мы исследуем бесчисленные возможности практического применения CRISPR на животных, растениях и человеке – как будущие, так и уже реализованные, – и обсуждаем невероятные перспективы и заметные трудности, ждущие на этом пути. Вы заметите, что книга рассказана от моего лица. Но ее писали мы оба, и мы оба разделяем большую часть выраженных в ней мнений. Мы выбрали такой способ изложения ради большей ясности и для того, чтобы наиболее полно раскрыть детали неповторимых впечатлений, полученных мной в течение многих лет.

Эта книга не задумывалась как строгое изложение истории CRISPR или как исчерпывающая хронология ранних этапов технологии редактирования генома. Мы скорее хотели подчеркнуть некоторые наиболее важные достижения в этой области и дать представление о том, как наша собственная работа сочеталась с результатами исследований других научных коллективов. Мы дали ссылки на источники там, где это было уместно, и призываем заинтересовавшихся читателей обращаться к дополнительным публикациям, чтобы получить больше информации о предмете, о котором мы пишем. Наконец, мы с огромным уважением отдаем должное бесчисленному множеству ученых, сыгравших ключевые и бесценные роли в изучении CRISPR и редактирования генома, и извиняемся перед теми коллегами, работы которых мы не смогли упомянуть из-за ограниченного объема книги.

Мы надеемся, что данная книга развеет мифы об этой восхитительной области науки и вдохновит вас разобраться в ней. Глобальная дискуссия по поводу редактирования генома уже началась; это исторический спор о будущем нашего мира – не больше и не меньше. Волна приближается. Давайте подплывем к ней и оседлаем ее вместе.

Часть I

Инструмент

Глава 1

В поисках исцеления

Недавно я услышала необыкновенную историю, которая хорошо показывает мощь и возможности технологии редактирования генома.

В 2013 году ученые из Национальных институтов здравоохранения США[6] столкнулись с медицинской загадкой. Изучая редкое наследственное заболевание, известное как синдром WHIM[7], они встретили пациентку, чье состояние казалось необъяснимым. В раннем возрасте у женщины (я буду называть ее Ким) была диагностирована эта болезнь, однако через много лет, когда специалисты НИЗ обследовали Ким, заболевание будто бы чудесным образом исчезло.

Синдром WHIM выявлен лишь у нескольких десятков человек в мире, и этот потенциально смертельный иммунодефицит приносит большие страдания тем, кому не повезло услышать такой диагноз. Причиной болезни является крошечная мутация – всего одна неправильная “буква” из 6 миллиардов “букв” ДНК: иными словами, заменены лишь около дюжины атомов. Но это крохотное изменение делает носителя синдрома WHIM чрезвычайно восприимчивым к заражению вирусом папилломы человека (ВПЧ), который вызывает образование неконтролируемо распространяющихся по всему телу бородавок. А они, в свою очередь, могут перерастать в рак.

О редкости заболевания наглядно говорит тот факт, что первой пациенткой, у которой сотрудники НИЗ диагностировали этот синдром еще в 1960-х годах, была Ким, ее же они и обследовали годы спустя (в научной литературе она известна как пациент WHIM-09). Ким страдала от болезни с рождения, и в течение жизни ее несколько раз госпитализировали из-за инфекций, связанных с синдромом.

В 2013 году Ким, которой к тому времени было уже 58 лет, пришла на обследование в НИЗ с двумя своими дочерьми, каждой из которых было по 20 с небольшим. У более молодой из двух женщин были классические симптомы заболевания, однако ученые очень удивились, когда обнаружили, что сама Ким казалась совершенно здоровой. Собственно, она это и подтвердила, заявив, что у нее нет никаких симптомов уже больше 20 лет. Поразительным образом Ким излечилась сама, без всякого медицинского вмешательства.

Ученые провели ряд экспериментов, чтобы понять, как произошло это спонтанное исцеление от потенциально смертельной болезни, и обнаружили некоторые важные зацепки. В клетках, взятых из щеки и с кожи Ким, все еще присутствовал мутантный ген, однако он необъяснимым образом исчез из клеток ее крови. Подвергнув ДНК кровяных клеток женщины более обстоятельному анализу, ученые обнаружили нечто еще более удивительное: у одной копии 2-й хромосомы отсутствовали целых 35 миллионов “букв” ДНК – и этот фрагмент целиком включал мутировавший ген под названием CXCR4. (Названия генов пишутся курсивом, а названия белков, которые кодируют эти гены, – прямым шрифтом. К примеру, ген HTT кодирует белок гентингтин; болезнь Гентингтона вызвана мутацией в гене HTT.) Остальные двести миллионов “букв” ДНК 2-й хромосомы были перемешаны – словно сквозь хромосому пронеслось торнадо и оставило ее составляющие в полном беспорядке.

Эти первоначальные открытия породили ряд новых вопросов. Как ДНК в клетках крови Ким стала такой “неорганизованной”, в то время как в других клетках организма она была в норме (не считая мутации в гене CXCR4)? Более того, почему, несмотря на то что хромосома, содержащая ген CXCR4, так сильно повреждена – на ней не хватает 164 генов! – клетки крови не просто выжили, но и нормально функционируют? Геном человека – полный набор всей генетической информации в наших клетках – содержит тысячи генов, необходимых для поддержания жизненно важных функций, таких как репликация ДНК и деление клеток, и казалось практически невероятным, что такое количество генов могут просто исчезнуть без вредных последствий для организма.

Проведя ряд опытов, ученые НИЗ понемногу приблизились к объяснению чудесного исцеления Ким. Они заключили, что в одной из клеток ее организма, должно быть, произошло редкое событие, обычно приводящее к катастрофическим последствиям, – хромотрипсис. Это явление было открыто недавно[8]; в результате хромотрипсиса хромосома внезапно разрушается, а затем восстанавливается, и это приводит к массовой перестановке генов в ней. Последствия такой трансформации для организма обычно либо незначительны (если поврежденная клетка немедленно умирает), либо очень серьезные (если перестановка в ДНК случайно активирует гены, вызывающие рак).

Однако в теле Ким хромотрипсис вызвал другие изменения. Мутировавшая клетка не просто нормально развивалась, но избавилась от гена, вызывающего синдром WHIM, так как в ней больше не было копии гена CXCR4, несущего болезнь.

Однако Ким повезло не только в этом. Ученые НИЗ определили, что “счастливая” клетка была, должно быть, гемопоэтической (кроветворной) стволовой клеткой. Из такой стволовой клетки происходят все виды кровяных клеток в теле, у нее есть практически неограниченный потенциал размножения и самообновления. Эта клетка передала свою измененную хромосому каждой дочерней клетке, что в итоге привело к обновлению всей иммунной системы Ким. Теперь в ней были только новые здоровые лейкоциты (белые кровяные тельца), в которых отсутствовала мутация гена CXCR4. Эта цепочка событий – настолько маловероятная, что я с трудом могла допустить мысль о реальности произошедшего, пока слушала доклад ученых, – фактически вывела из тела Ким неизлечимую болезнь, от которой она страдала с рождения.

Ученые, исследовавшие здоровье Ким, пришли к выводу, что природа будто бы провела над удачливой женщиной “беспрецедентный эксперимент”, в ходе которого всего одна стволовая клетка прошла через ряд спонтанных изменений, которые избавили как ее саму, так и все дочерние клетки от гена, несущего болезнь. Это была случайность – и, если бы события развивались немного иначе, эта случайность, попросту говоря, могла бы убить Ким, а не спасти ей жизнь.

Чтобы понять, насколько неожиданно благоприятным был такой исход, представьте, что геном человека – это большая компьютерная программа. В случае Ким в программе среди шести миллиардов “букв” содержалась всего одна “буква” некорректного кода. Чтобы найти эту неверную “букву”, вы вряд ли бы стали случайным образом, наугад удалять большие куски кода и перемешивать другие его части: это не только не исправило бы изначальную ошибку, но и привело бы к другим, гораздо более опасным. Только в случае чрезвычайного везения – вероятность такого везения была бы один к миллиону или даже к миллиарду – вы бы умудрились не только удалить именно тот кусок кода, что содержал ошибку, но и не нарушить при этом ключевые функции программы. Коротко говоря, это и случилось в геноме Ким – только работавшим наугад программистом была сама природа.

Однако как бы удивителен ни был случай Ким, еще больше поражает то, что он не уникален. Хотя это и единственный описанный случай исцеления пациента в результате спонтанного разрушения и последующего восстановления хромосомы, в научной литературе есть и другие примеры[9] пациентов, которые частично или полностью излечились после случайных, спонтанных исправлений мутаций. Например, в 1990-х у двух пациентов из Нью-Йорка выявили тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) – наследственное заболевание, которое также называют синдромом “мальчика в пузыре” (из-за стерильных условий, в которых приходилось держать некоторых детей, чтобы минимизировать возможный контакт с болезнетворными микроорганизмами). Без строжайшей изоляции или интенсивных форм терапии маленькие пациенты с диагнозом ТКИД обычно умирают, не дожив и до двух лет. Однако двое пациентов из Нью-Йорка оказались исключением из этого ужасного правила: они на удивление хорошо себя чувствовали и в подростковом, и во взрослом возрасте. В обоих случаях, как определили ученые, клетки пациентов спонтанно скорректировали мутацию в гене ADA, несущую болезнь, причем эта коррекция не потревожила остальные гены хромосомы[10].

Известны и другие похожие случаи, когда сама природа редактировала геном, избавляя людей от наследственных заболеваний, таких как синдром Вискотта – Олдрича[11] (от этого недуга целых 10–20 % процентов больных спасает именно спонтанная коррекция генома) или болезнь печени под названием тирозинемия[12]. В случае некоторых кожных заболеваний присутствие клеток с отредактированным геномом можно увидеть невооруженным взглядом: при одном из видов ихтиоза, имеющем выразительное название “ихтиоз с конфетти”[13], у больных на коже появляются участки красной, шелушащейся кожи. Клетки в этих местах несут генетическую мутацию, однако клетки окружающих, здоровых участков кожи смогли ее исправить.

Однако в общем и целом шансы на спонтанное излечение от наследственного заболевания минимальны. С большинством пациентов никогда не произойдет такого чуда природы – чтобы гены сами изменились абсолютно правильным образом, именно в нужных клетках и в нужных тканях. Редактирование генома самой природой – это аномалия, интересный медицинский курьез, затронувший небольшое количество пациентов, выигравших в “генетическую лотерею”.

Но что, если бы редактирование генома было не только спонтанным явлением? Что, если бы врачам был доступен какой-нибудь способ корректировать вредоносные мутации, которые вызывают синдромы WHIM, ТКИД, тирозинемию – и, если уж на то пошло, любое наследственное заболевание?

У многих ученых, включая и меня, случаи, подобные истории болезни Ким, вызвали повышенный интерес – не только потому, что они обнаруживали целительную мощь природы, редактирующей геном, но также потому, что они наталкивали на мысль о возможности нового вида медицинского вмешательства: рационального и точно рассчитанного исправления ошибок в геноме. Исправления, которое могло бы устранить неприятные симптомы наследственных заболеваний. Истории этих везучих людей продемонстрировали, что намеренное редактирование генома стало бы возможно, если бы у ученых были нужные генетические данные и необходимые биотехнологические инструменты.

В течение десятилетий, задолго до того, как я посвятила себя этой области знаний, специалисты по медико-биологическим наукам бились над тем, чтобы получить эти данные и разработать такие инструменты. Более того, ученые мечтали о терапевтическом редактировании генома еще до того, как было обнаружено, что сама природа подсказывает, как это можно сделать. Но чтобы сделать такую технологию реальной, исследователям необходимо было понять сам геном: из чего он сделан, как он строится и – что наиболее важно – каким образом можно вносить в него изменения и “настраивать” его. Только обладая подобной базовой информацией, первопроходцы этой научной области и их последователи могли предпринять первые неуверенные шаги по направлению к лечению людей – людей не настолько везучих, как Ким, которой посчастливилось исцелиться самой.

Термин “геном”, предложенный в 1920 году немецким ботаником Гансом Винклером и, возможно, образованный слиянием слов “ген” и “хромосома”, описывает всю совокупность наследственного материала в клетке организма[14]. В большинстве случаев он идентичен в каждой клетке любого организма (за исключением отдельных клеток с мутациями). В геноме содержится информация – инструкции, согласно которым организм любого живого существа растет, поддерживает себя и передает гены потомкам. У одного организма геном вызывает развитие плавников и жабр для движения и дыхания под водой; у другого – рост листьев и выработку хлорофилла для получения энергии из солнечного света. Присущие нам физические черты: зрение, рост, цвет кожи, предрасположенность к недугам и т. д. – соответствуют информации, закодированной в наших геномах.

Геном образуют молекулы, которые называются дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) и состоят всего лишь из четырех различных видов структурных элементов – нуклеотидов, тех самых “букв” ДНК: А, Г, Ц и Т. Эти буквы – сокращения названий химических групп, азотистых оснований, которыми нуклеотиды отличаются друг от друга: аденин, гуанин, цитозин и тимин. “Буквы” молекул связаны в длинные одинарные цепочки. Две такие цепочки образуют знакомую нам всем спиральную структуру.

Эта структура чем-то напоминает лесенку, скрученную в длинную двойную спираль. Две цепочки ДНК оборачиваются друг вокруг друга вдоль центральной оси, а сахарофосфатный остов каждой цепи остается на внешней стороне спирали; если продолжить сравнение, можно сказать, что эти элементы как бы образуют перила лестницы. При таком расположении элементов азотистые основания четырех типов оказываются в центре спирали и находятся ближе всего к оси, встречаясь в середине молекулы; это “ступеньки” лестницы. Элегантная черта этой структуры – набор химических взаимодействий, благодаря которым цепочки связаны в каждой ступеньке. Это своего рода “молекулярный клей”: “буква” А с одной цепочки всегда образует пару с “буквой” Т на другой цепочке, а Г – с Ц. Эти пары “букв” называют парами оснований.

Двойная спираль прекрасно демонстрирует молекулярные основы наследственности; именно с помощью этой структуры относительно простое химическое соединение ДНК может при делении клетки передавать генетическую информацию двум дочерним клеткам; таким же образом информация может в дальнейшем распространяться в каждую клетку целого растения или животного. Благодаря тому, что молекула состоит из двух цепочек, и тому, что существуют правила, согласно которым эти цепочки соединяются (А – только с Т, Г – только с Ц), каждая из них представляет собой точный шаблон для соответствующей пары[15].

Структура двойной спирали ДНК

Незадолго до деления клетки две цепочки разделяются ферментом, который “расстегивает” двойную спираль прямо по центру, будто застежку-“молнию”. После этого другие ферменты подбирают новую пару для каждой цепочки, используя те же самые правила для формирования пар оснований, в результате чего образуются две точные копии оригинальной двойной спирали.

Мое собственное знакомство с двойной спиралью ДНК совпало с другим моим открытием: оказывается, ученые способны изучать молекулы, слишком маленькие для того, чтобы их можно было разглядеть даже в самый мощный оптический микроскоп. Мне было около двенадцати, когда я, вернувшись однажды домой из школы, обнаружила на своей постели потрепанную книгу Джеймса Уотсона “Двойная спираль” (мой отец иногда выбирал для меня ту или другую подержанную книгу в букинистическом магазине, чтобы посмотреть, не заинтересует ли она меня). Я подумала, что это какой-то детектив (и так ведь оно и было!), и отложила книгу на несколько недель, прежде чем погрузиться в чтение одним дождливым субботним днем.

Уотсон рассказывал о том, как научное сотрудничество с Фрэнсисом Криком позволило им обоим – используя критически важную информацию, собранную их коллегой Розалинд Франклин, – расшифровать эту простую и красивую молекулярную структуру. Именно тогда я ощутила первую искру интереса, который в конце концов и заставил меня выбрать похожий путь в жизни. (Много лет спустя я смогла резко ускорить собственную научную карьеру, расшифровав некоторые из первых трехмерных структур РНК – куда более сложных!)

В годы, которые последовали за открытием Уотсона и Крика, другие ученые пытались понять, каким образом структура этой молекулы и ее достаточно простые химические составляющие могут кодировать информацию и объяснять многочисленные биологические явления. ДНК похожа на какой-то тайный, зашифрованный язык: каждая последовательность “букв” предоставляет собой инструкцию для образования определенного белка внутри клетки. Затем эти белки выполняют большинство жизненно важных функций в организме, например расщепляют пищу, распознают и уничтожают болезнетворные микроорганизмы, чувствуют свет.

Чтобы превратить инструкции, содержащиеся в ДНК, в белки, клетки используют важнейшую (и близкородственную ДНК) молекулу рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая образуется по шаблону ДНК в ходе процесса, который называется транскрипцией. Три “буквы” в РНК совпадают с “буквами” ДНК, однако “буква” Т (тимин) заменена на У (урацил). Кроме того, сахар, образующий остов РНК, содержит на один атом кислорода больше, чем атом сахара в ДНК (потому-то последнюю и называют дезоксирибонуклеиновой кислотой). РНК выступает в качестве передатчика информации от клеточного ядра, в котором находится ДНК, во внешнюю часть клетки, где образуются белки. В этом процессе (он называется трансляцией) клетки используют для создания отдельных молекул белков длинные цепочки РНК, которые образуются с использованием информации с определенных фрагментов ДНК – участков кода, называемых генами. Каждые три “буквы” РНК, поставленные рядом, соответствуют одной аминокислоте (аминокислоты – это “строительные блоки” белков). Гены и соответствующие им белковые продукты отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов (в генах) и аминокислот (в белках). Этот общий поток генетической информации – от ДНК к РНК к белку – известен как центральная догма молекулярной биологии, и именно на этом языке “общается” и выражает себя жизнь.

Размер генома и число генов, содержащихся в нем, сильно различаются у представителей различных царств живого мира. У большинства вирусов, например, всего несколько тысяч “букв” ДНК (или РНК, так как в некоторых вирусных геномах нет ДНК) и небольшое количество генов. Геномы бактерий, с другой стороны, содержат миллионы “букв” и около 4000 генов. В геноме мух около 14 000 генов, распределенных среди сотен миллионов пар оснований ДНК. В человеческом геноме около 3,2 миллиарда “букв” ДНК и около 21 000 генов, кодирующих белки. Любопытно, что размер генома не всегда соответствует сложности организма; геном человека приблизительно такой же длины, как геном мыши или лягушки, где-то в десять раз короче, чем геном саламандры, и более чем в сто раз меньше, чем геномы некоторых растений.

Центральная догма молекулярной биологии[16]

Геномы различных видов живых существ могут иметь совершенно различную структуру. В то время как большинство бактериальных геномов существуют внутри клетки в виде одной непрерывной последовательности ДНК, человеческий геном состоит из 23 отдельных частей, которые называются хромосомами и имеют длину от 50 до 250 миллионов “букв”. Как и клетки большинства млекопитающих, клетки человека обычно содержат две копии каждой хромосомы, одну от отца, другую от матери. Каждый родитель передает ребенку 23 хромосомы, так что всего их получается 46. (Существуют исключения из этого правила; например, у людей с синдромом Дауна есть третья копия 21-й хромосомы.) Полный набор ядерных хромосом может быть найден практически в любой клетке тела (важное исключение – красные кровяные тельца, так как у них нет ядра[17]), однако ДНК хранится не только в ядре. В геном человека также входит отдельная мини-хромосома – она содержит всего 16 000 “букв” ДНК и расположена в митохондриях, “батарейках” клетки, производящих энергию. В отличие от генетического кода других хромосом, митохондриальная ДНК наследуется исключительно по материнской линии[18].

Мутации в любой из 23 пар хромосом или в митохондриальной хромосоме могут вызывать наследственные заболевания. Простейшая мутация называется точечной заменой – в этом случае один нуклеотид заменен на другой, и в результате соответствующий ген будет кодировать дефектный белок. К примеру, серповидноклеточная анемия, наследственное заболевание крови, случается при замене семнадцатой “буквы” гена под названием бета-глобин (с А на Т). При переходе от нуклеотидов к аминокислотам, то есть в ходе трансляции, эта мутация приводит к тому, что глутамат заменяется на валин, причем происходит это в критической области белка гемоглобина – компонента эритроцитов (красных кровяных телец), транспортирующего кислород. Последствия этого крошечного изменения в белке – меняются лишь десять атомов из более чем восьми тысяч – очень серьезны. Мутировавшие молекулы гемоглобина слипаются и образуют аномальные волокна, меняющие форму эритроцитов, что ведет к анемии, повышенному риску инсульта и инфекций, а также к сильной боли в костях.

Серповидноклеточная анемия – пример генетического заболевания, наследуемого по рецессивному типу. Это означает, что болезнь возникает тогда, когда обе копии гена HBB в организме несут мутацию; если изменения есть только в одной копии, то немутировавший ген может произвести достаточно нормального гемоглобина, чтобы нивелировать негативное воздействие мутантного гемоглобина. Люди, у которых лишь одна копия гена HBB мутантная, все равно являются носителями серповидноклеточной анемии, и хотя обычно это не влияет на их здоровье, они все же могут передать дефектный ген потомству.

Другие генетические заболевания наследуются по доминантному типу, что означает, что всего одной мутантной копии гена достаточно, чтобы вызвать болезнь. Один из примеров этого – синдром WHIM, при котором тысячная “буква” гена CXCR4 меняется с Ц на Т; мутировавший ген кодирует гиперактивный белок, который нивелирует работу здорового гена.

И серповидноклеточная анемия, и синдром WHIM – примеры генетических заболеваний, вызываемых простыми точечными заменами (ошибочной подменой одной “буквы” ДНК на другую). Однако генетические заболевания могут быть и результатом вставки (инсерции) или утраты (делеции) фрагментов ДНК. К примеру, нейродегенеративное расстройство, известное как хорея Гентингтона, происходит из-за мутации в гене HTT, в котором одни и те же три “буквы” ДНК повторяются слишком много раз. Это заставляет клетки мозга производить аномальные белки, постепенно разрушающие эти клетки. А вот муковисцидоз (опасное для жизни наследственное заболевание, которое поражает главным образом легкие), напротив, возникает из-за удаления трех “букв” генетического кода в гене CFTR, что приводит к тому, что белок лишается важной аминокислоты и его функционирование нарушается. Другие заболевания возникают, когда участки гена инвертированы (расположены в обратном порядке) или когда фрагменты хромосом или даже целые хромосомы по ошибке удвоены или отсутствуют.

О генетических причинах многих болезней стало известно благодаря относительно недавнему изобретению секвенирования ДНК – процесса, который позволяет ученым прочитывать и записывать содержимое генома человека “буква за буквой”. После того как в 1970-х годах появились первые методы секвенирования, ученые начали кропотливо искать и идентифицировать генетические причины наиболее известных на тот момент наследственных заболеваний. “Квантовый скачок” в этой области произошел, когда был осуществлен проект “Геном человека”, начавшийся в 1990-х годах, когда ученые со всего мира объединились, чтобы отсеквенировать весь геном человека. При выполнении этой амбициозной задачи была использована новая технология, которая позволяла клонировать большие фрагменты ДНК человека в дрожжах. Реализации проекта также способствовали значительный прогресс в автоматизации лабораторных процессов и разработка сложных вычислительных алгоритмов для облегчения анализа данных, полученных при секвенировании. Проект стоил огромных усилий и средств (около 3 миллиардов долларов), и в 2001 году был опубликован первый “черновой вариант” генома.

С момента завершения проекта “Геном человека” процесс секвенирования ДНК и секвенирования целых геномов стал удивительно быстрым, дешевым и эффективным. Ученые точно идентифицировали более четырех тысяч различных мутаций, способных вызывать генетические заболевания. Секвенирование ДНК помогает выявить повышенный риск развития некоторых видов рака, подбирать индивидуальные методики лечения для пациентов с различной наследственностью. Сегодня коммерческий анализ ДНК стал общедоступным: он стоит лишь несколько сотен долларов за каждый тест, и миллионы людей решили сделать анализ собственных геномов, для чего им нужно было лишь предоставить образец слюны. Последовало значительное увеличение объема данных о человеческом геноме, что помогло исследователям выявить важные связи между тысячами вариантов генов и рядом физических и поведенческих черт.

И все же, несмотря на то что секвенирование генома отражает огромный прогресс в изучении наследственных недугов, это в конечном счете лишь диагностический инструмент, но не средство для их лечения. Оно помогло нам увидеть, как наследственные заболевания записываются на языке ДНК, однако секвенирование не дает нам никаких возможностей для изменения этого языка. В конце концов, научиться читать – далеко не то же самое, что научиться писать. Для этого ученым нужен совершенно другой набор инструментов.

Исследователи мечтали о связанных с ДНК методах лечения с тех пор, как было открыто существование генетических заболеваний. Когда некоторые ученые только начинали определять основополагающие причины наследственных заболеваний, другие уже находились в напряженном поиске новых методов лечения этих недугов – методов, которые позволили бы не только давать пациентам препараты, временно смягчающие нежелательные эффекты генной мутации, но и исправлять сам мутировавший ген, чтобы навсегда остановить болезнь. Приведу пример: серповидноклеточная анемия лечится сегодня при помощи частых переливаний крови, использования препарата гидроксикарбамида и пересадки костного мозга. Разве не лучше было бы атаковать саму мутацию ДНК, вызвавшую заболевание?

Пионеры исследований в этой области знали, что лучшим решением для лечения наследственных заболеваний было бы исправление дефектного гена – то есть целенаправленно проделать то же самое, что природа сделала случайно, исцелив Ким и других везучих пациентов вроде нее. Однако идея лечения наследственных недугов посредством переписывания мутантного генетического кода казалась фантастической – нечто поиска иголки в стоге сена, а потом вытаскивания ее из этого стога, причем нельзя было задеть при этом ни одной соломинки. Но вместе с тем ученые подозревали, что похожих изменений можно было бы добиться, добавляя целые замещающие гены в поврежденные клетки. Вопрос состоял в том, каким образом доставить этот ценный груз в нездоровый геном.

Зная о том, что вирусы обладают необычной способностью “вклеивать” новую генетическую информацию в ДНК бактериальных клеток, пионеры исследований генной терапии поняли, что вирусы можно использовать для доставки “лечебных генов” людям. Первые опыты подобного рода были проведены в конце 1960-х годов американским врачом Стэнфилдом Роджерсом – он изучал папилломавирус Шоупа, вызывающий вырастания на коже у кроликов. Роджерса особенно заинтересовала одна особенность этого вируса: в телах зараженных кроликов вырабатывалось слишком много аргиназы – фермента, нейтрализующего вредную аминокислоту аргинин[19]. В организмах больных кроликов было гораздо больше аргиназы и меньше аргинина, чем у здоровых животных. Кроме того, Роджерс обнаружил, что у исследователей, работавших с вирусом, уровень аргинина в крови также был ниже нормы. Видимо, эти ученые подхватили вирус от кроликов, и эта инфекция вызвала долгосрочные изменения также и в их телах.

Роджерс начал подозревать, что вирус Шоупа доставлял в клетки ген, ответственный за повышенную выработку аргиназы. Он удивился, что вирус способен переносить генетическую информацию столь эффективно, и задался вопросом: а смогла бы специально сконструированная версия вируса доставлять в клетки другие, полезные гены? Много лет спустя Роджерс вспоминал: “Было ясно, что в поисках болезни мы открыли средство лечения!”[20]

Ему не пришлось долго ждать случая, чтобы протестировать свою теорию на реальных пациентах. Спустя всего несколько лет у двух девочек из Германии было диагностировано наследственное расстройство под названием гипераргининемия. Как и у кроликов, инфицированных папилломавирусом Шоупа, у пациенток были аномальные уровни аргинина в крови – однако на этот раз не пониженные, а слишком высокие. Ген, ответственный за производство аргиназы (как подозревал Роджерс, именно этот ген переносился вирусом Шоупа), в организмах девочек либо отсутствовал, либо мутировал.

Симптомы гипераргининемии ужасны: в их числе постепенно усиливающиеся спазмы, эпилепсия и серьезная умственная отсталость. Однако был шанс, что вмешательство на ранней стадии, особенно в случае младшей пациентки, могло предотвратить наиболее тяжелые последствия заболевания. Роджерс и его немецкие коллеги ввели девочкам вирус Шоупа в терапевтических целях, сделав инъекцию больших доз очищенного вируса кроликов прямо в кровоток.

К сожалению, экспериментальная генная терапия Роджерса обернулась разочарованием – и не только для него, но и, что более печально, для его пациентов и их семьи. Инъекции не оказали почти никакого воздействия ни на одну из девочек, а Роджерса массово порицали за процедуру, которую многие его коллеги сочли безрассудной и непродуманной[21]. Дальнейшее исследование показало, что вопреки предположениям Роджерса в вирусе Шоупа даже не содержалось гена аргиназы[22], поэтому он не мог никак быть полезен для лечения гипераргининемии.

Хотя Роджерс больше никогда не предпринимал попыток провести генную терапию, его идея об использовании вирусов в качестве средства доставки генов в клетки – ученые называют такие средства векторами – произвела революцию в биологии. Эксперимент не удался, однако общий принцип Роджерса оказался верным, и перенос генов при помощи вирусов до сих пор является одним из наиболее эффективных известных способов вставки генов в геном клетки – и, следовательно, изменения генетического кода живых организмов.

Вирусы эффективны в качестве векторов благодаря нескольким своим характерным особенностям. Начать с того, что в результате своей эволюции вирусы научились невероятно эффективно проникать в клетки любого типа. С тех пор как на Земле существует жизнь, организмам всех царств – бактериям, растениям, животным и т. д. – приходилось бороться с паразитическими вирусами, единственной целью которых является “взлом” клетки и вставка в нее собственной ДНК, чтобы эта клетка вырабатывала множество новых копий вирусных частиц. На протяжении тысячелетий эволюции вирусы выработали способность использовать практически любое слабое место в клеточной защитной системе и усовершенствовали стратегии “доставки” своего генетического груза внутрь клетки. Вирусные векторы поразительно надежны в качестве инструмента; работающие с ними исследователи могут доставить гены в необходимые клетки с практически стопроцентной эффективностью. Для ученых, которые первыми использовали этот вид терапии, вирусные векторы были чем-то вроде троянского коня.

Вирусы способны не только переносить свою ДНК внутрь клетки, но и обеспечивать ее сохранение там. В 1920–1930-е годы, на заре генетических экспериментов на бактериях, ученые недоумевали по поводу способности бактериальных вирусов возникать словно из ниоткуда и вызывать инфекции. Дальнейшие исследования показали, что эти вирусы могут вносить свой геном в бактериальную хромосому и таиться там до тех пор, пока условия не станут подходящими для интенсивного инфицирования. Ретровирусы – большой класс вирусов, к которым относится, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), – проделывают то же самое в организме человека, внося свой генетический материал в геном инфицированных клеток. Из-за этого вредоносного свойства уничтожить ретровирусы чрезвычайно сложно, и они сумели оставить огромный след в наследственности нашего вида. Целых 8 % генома человека – около 250 миллионов “букв” ДНК – это наследие древних ретровирусов, которые поражали наших предков много тысячелетий назад.

Генная терапия с использованием вирусных векторов

За первыми попытками генной терапии в 1960-х последовало быстрое развитие этой научной области, которое происходило благодаря революционной разработке, известной как рекомбинантная ДНК, – это собирательный термин для генетического кода, искусственно созданного в лаборатории. Используя новые биотехнологические инструменты и новые биохимические методы, ученые в 1970-х и 1980-х годах научились вырезать и вставлять фрагменты ДНК в геномы и выделять заданные последовательности генов. Это позволило им вставлять “лечебные” гены в вирусы и удалять опасные гены таким образом, что вирусы больше не вредили инфицированным клеткам. Ученые фактически превратили эти вирусы в нечто вроде тихих снарядов, предназначенных для того, чтобы доставить свой генетический заряд точно в нужную цель – и никуда более.

К концу 1980-х были проведены эксперименты на мышах, и в ходе этих экспериментов перенастроенные ретровирусы успешно вставляли произведенные в лаборатории гены в ДНК животных; теперь предстояло испытать генную терапию в клинических условиях. В это время я работала в Гарварде, проводила там исследования для своей докторской диссертации по биохимии; я помню, как мы с коллегами по лаборатории обсуждали новость о том, что Френч Андерсон и его коллеги из Национальных институтов здравоохранения первыми смогли провести клинические испытания. Они разработали многообещающий вектор, снабженный здоровой копией гена ADA (аденозиндезаминазы). Из-за мутации этого гена возникает недостаточность аденозиндезаминазы – формы ТКИД (тяжелого комбинированного иммунодефицита). Команда Андерсона хотела использовать генную терапию для того, чтобы навсегда включить здоровый ген ADA в состав кровяных телец пациентов, страдающих от ТКИД, – таким образом, чтобы эти клетки смогли вырабатывать недостающий белок. Андерсон и его коллеги надеялись, что это приведет к излечению от болезни.

К сожалению, результаты этого первого клинического испытания оказались не вполне ясными; перестроенный вирус вроде бы не причинил вреда ни одному из двух пациентов, которые его получили, однако и эффективность метода было трудно определить. К примеру, после проведения этой процедуры у обоих пациентов увеличилось количество жизнеспособных иммунных клеток – однако это улучшение могло быть вызвано и другими средствами, которые больные принимали параллельно с проведением генной терапии. Более того, в реальности лишь очень небольшое число клеток получило здоровый ген ADA, а это означало, что вирус, вероятно, не настолько эффективен в качестве средства доставки генов, как надеялись ученые.

Однако за три десятилетия, прошедших со времени этого первого и не слишком убедительного опыта, в области генной терапии происходил феноменальный прогресс. Усовершенствования в конструировании вирусных векторов и методов их доставки в клетки привело к чрезвычайно воодушевляющим результатам генной терапии ADA у десятков больных ТКИД, и коммерческий препарат под названием стримвелис, скорее всего, скоро будет одобрен экспертами[23].

По состоянию на 2016 год было проведено около 2000 испытаний различных видов генной терапии, и список недугов, поддающихся лечению этим методом, значительно расширился: теперь он включает такие моногенные наследственные заболевания, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия, некоторые виды слепоты, а также все большее число различных сердечно-сосудистых и неврологических недугов. А перспективный метод иммунотерапии рака – при котором клетки, сражающиеся с опухолью, “заряжаются” генами, нацеленными на специфичные для опухолей молекулы, – был назван одним из самых многообещающих прорывов в онкологии и подтверждением того, что генная терапия еще много чего может предложить медицине.

Но, несмотря на шумиху, генная терапия пока не стала панацеей, как надеялись ученые и медики; напротив, в некоторых случаях она, кажется, принесла больше вреда, чем пользы. Тяжелый удар по этой области нанес 1999 год, когда один пациент умер после мощного иммунного ответа его организма на большую дозу вирусного вектора. В то время я преподавала в Йельском университете и была полностью погружена в исследования способа, которым вирусные молекулы РНК “взламывают” белоксинтезирующие системы в клетках. Хотя область моих исследований не слишком пересекалась с генной терапией, новости об этом катастрофическом исходе расстроили меня и одновременно заставили более целеустремленно работать над тем, чтобы лучше понимать устройство вирусов и клеток.

Позже, уже в начале 2000-х, у пяти пациентов, которым проводили генную терапию сцепленного с X-хромосомой ТКИД, развилась лейкемия – рак красного костного мозга. Это произошло из-за того, что ретровирус ошибочно активировал некий онкоген (один из генов, вызывающих рак), и это привело к неконтролируемому размножению клеток. Этот инцидент подчеркнул неотъемлемый риск, присущий методу, при котором пациентам вводятся большие количества чужеродного агента, а в их геномы случайно встраиваются несколько тысяч “букв” ДНК. Я помню, как тогда подумала, что эта область клинических исследований, в принципе столь многообещающая, может оказаться неприемлемо рискованной.

Кроме того, генная терапия по своей сути неэффективна для широкого ряда генетических заболеваний, которые не вызваны отсутствием или мутацией генов. Такие заболевания не могут быть исправлены простым добавлением новых генов в клетки. Возьмем, к примеру, хорею Гентингтона, при которой измененный ген вырабатывает белок аномального строения и действие этого гена полностью нивелирует действие другого, здорового. Так как мутантный ген доминирует над нормальным, простая генная терапия – то есть добавление еще одной нормальной копии гена с помощью специально видоизмененного вируса – никак не поможет в случае хореи Гентингтона или других заболеваний, наследуемых по доминантному типу.

В таких (и подобных) случаях врачам придется найти способ “починить” проблемные гены, а не просто заменить их. И если бы они научились восстанавливать дефектный код, вызывающий расстройства, то научились бы лечить как рецессивные, так и доминантные наследственные заболевания, не боясь при этом добавить ген не туда, куда следует.

Эта возможность интриговала меня с самого начала карьеры. В начале 1990-х, уже получив степень доктора философии[24] в Гарвардском университете, я в течение многих вечеров обсуждала эту идею с коллегами по лаборатории в Колорадском университете в Боулдере, где я была постдоком[25]. В те дни мы с моим другом и коллегой Брюсом Салленджером спорили обо всем подряд – от президентских выборов 1992 года (мне нравился Пол Цонгас, а Брюсу – Билл Клинтон) до различных стратегий генной терапии. Один из вопросов, который мы обсуждали, был таким: возможно ли отредактировать молекулы РНК – то самое связующее звено между ДНК и белком в клетке – таким образом, чтобы исправить мутации, которые эти молекулы “наследовали” от ДНК? Помимо всего прочего, это была тема исследовательского проекта Брюса. Иногда мы также обсуждали другую возможность: редактирование “исходного кода” таких дефектных РНК – то есть самой ДНК генома. Мы оба считали, что этот метод изменил бы все. Вопрос состоял лишь в том, удастся ли когда-нибудь воплотить эту идею в действительность.

На протяжении 1980-х, в то время как некоторые исследователи оттачивали методы переноса генов с использованием вирусов, другие искали более простые пути трансформации клеток млекопитающих, используя ДНК, изготовленную в лаборатории. Эти базовые методы предназначались прежде всего для фундаментальной науки, но со временем ученые начали также исследовать их потенциал для лечения клеток человека.

У этих подходов было несколько ключевых преимуществ перед более сложными техниками переноса генов. Прежде всего они были гораздо более быстрыми; вместо того чтобы “упаковывать” гены в перенастроенные вирусы, ученые могли вводить созданную в лаборатории ДНК напрямую в клетки или делать так, чтобы клетки сами поглотили ее: для этого последние погружались в специально приготовленную смесь ДНК и фосфата кальция. Во-вторых, хотя в этих более простых методах и не применялось встраивание новых генов в геномы клеток при помощи вируса, клетки могли объединять чужеродную ДНК со своей собственной – пусть и не слишком эффективно.

Мыши часто становились первыми подопытными животными, на которых тестировались эти техники, и ученые поражались тому, насколько эффективными оказывались такие методы применительно к маленьким созданиям. Вводя новую ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мышей и затем имплантируя эти яйцеклетки в женские особи, исследователи обнаружили, что они могли перманентно встроить чужеродную ДНК в геномы представителей следующего поколения и вызвать наблюдаемые изменения в развивающихся животных. Эти достижения означали, что любой ген, который ученые были способны изолировать и клонировать в лаборатории, можно было попробовать ввести в клетку и изучить его поведение там; добавляя этот ген в клетки, ученые могли наблюдать его воздействие на организм и лучше понять его функции. Хотя моя научная работа в то время была в основном посвящена формам и функциям молекул РНК, я осознавала, что потенциальные последствия этих открытий были огромны.

Вопрос состоял в следующем: каким именно образом ДНК находит путь к геному? Марио Капекки, профессор университета Юты, пытался ответить на этот вопрос в начале 1980-х, сделав одно необъяснимое наблюдение: когда в один геном “подселяли” сразу много копий какого-нибудь гена, эти копии интегрировались в геном вовсе не беспорядочно, как этого можно было бы ожидать, а прямо наоборот. Капекки обнаружил, что копии гена, вместо того чтобы распределяться хаотическим образом по разным хромосомам генома, всегда собирались вместе в одной или немногих областях, при этом многие копии накладывались друг на друга, как будто их так собрали таким образом умышленно. Впоследствии ученый установил, что именно так оно и было[26].

Капекки наблюдал результаты процесса, называемого гомологичной рекомбинацией, – в тот момент это был уже хорошо известный феномен, однако ученый не ожидал наткнуться на него в этом эксперименте. Наиболее известный пример гомологичной рекомбинации – происходящая во время формирования яйцеклеток и сперматозоидов редукция каждого двойного набора хромосом (половину которого мы получили от матери, а половину от отца) до одинарного, который затем объединится со вторым таким же набором (у другого партнера) в ходе полового размножения[27]. В этом процессе избавления от “лишнего” клетки выбирают смесь отцовских и материнских хромосом; каждая пара хромосом вступает в своего рода половой акт, обмениваясь крупными фрагментами ДНК таким образом, что генетическое разнообразие в пределах одной хромосомы увеличивается. Несмотря на головоломную сложность смешивания, сопоставления и пересборки цепей из миллионов “букв” ДНК, клетки могут выполнять эти задачи безупречно именно благодаря процессу гомологичной рекомбинации. Тот же процесс происходит во всех царствах живых существ: к примеру, бактерии с его помощью обмениваются генетической информацией, а биологи пользуются преимуществами гомологичной рекомбинации для проведения генетических экспериментов на дрожжах в течение многих лет.

Тем не менее открытие того факта, что клеткам лабораторных млекопитающих также свойственно явление гомологичной рекомбинации, имело огромное значение. Марио Капекки писал в конце своей статьи 1982 года:

Будет интересно определить, сможем ли мы использовать [вовлеченные в процесс ферменты], чтобы путем гомологичной рекомбинации направленно воздействовать на гены, расположенные в определенных участках хромосом[28].

Другими словами, гомологичная рекомбинация позволяет ученым с безупречной точностью вставлять гены в подходящие места генома – а это поразительное усовершенствование по сравнению со случайной вставкой генов с помощью вирусов. И, что еще важнее, гомологичная рекомбинация может дать ученым возможность “переписывать” дефектные гены, помещая здоровые гены прямо в то место, где произошла мутация.

Спустя всего три года после экспериментов Капекки эта возможность воплотилась в реальность в примечательной научной работе, статью о которой опубликовал Оливер Смитис с коллегами. Работая с человеческими клетками, взятыми из опухолей мочевого пузыря, ученые поставили перед собой задачу заменить “доморощенные” копии гена бета-глобина в клетках на искусственные рекомбинантные версии, сконструированные в лаборатории. Невероятно, но это сработало[29]. Ученым не пришлось использовать никаких необычных трюков – они просто смешали ДНК с фосфатом кальция и опрыскали клетки полученной смесью – некоторые из клеток поглотили чужеродную ДНК, создали пары из разработанных в лаборатории цепочек ДНК и собственных подходящих последовательностей в геноме, а затем посредством некоторой “молекулярной гимнастики” заменили старые на новые.

Казалось, клетки могут проделывать большую часть сложной работы по модификации собственных геномов без посторонней помощи. Это означало, что ученые могли доставлять гены более мягким способом, не используя вирусы для “запихивания” новой ДНК в геном. Заставляя клетки “думать”, что рекомбинантная ДНК была лишь дополнительной хромосомой, которой нужно найти пару с подходящим геном, уже имеющимся в геноме, ученые могли гарантировать, что новая ДНК соединялась с изначально находящейся в клетке посредством гомологичной рекомбинации.

Ученые назвали этот новый подход к манипуляции с генами направленным воздействием на гены. Сегодня этот метод известен под другим именем: редактирование генома.

Потенциал этой технологии для генетических исследований был невероятно заманчив. Однако Смитис знал, что гомологичная рекомбинация может быть также использована и в качестве терапии. Если бы ученые смогли провести аналогичное направленное воздействие на гены в стволовых клетках пациентов, страдающих от серповидноклеточной анемии, то мутировавший ген бета-глобина можно было бы заменить на нормальную, здоровую последовательность. Открытие Смитиса было сделано в рамках экспериментального подхода, однако в один прекрасный день оно потенциально могло быть использовано для лечения заболеваний.

Другие лаборатории также вступили в конкуренцию за усовершенствование этой техники направленного воздействия на гены. Одной из них была лаборатория Капекки. В 1986-м, когда я была на втором курсе магистратуры, он показал, что гомологичная рекомбинация достаточно точна для того, чтобы исправлять даже точечные мутации в геноме и корректировать недостаточность ферментов в клетках[30]. Два года спустя Капекки предложил общую стратегию направленного воздействия на любой ген с известной последовательностью нуклеотидов в любом геноме. Он также предположил, что гомологичную рекомбинацию можно использовать не только для исправления и “ремонта” генов, но и для их инактивации в исследовательских целях[31]; “выключая” гены и наблюдая, что получится в результате, ученые могли определять функции этих генов.

Редактирование генома посредством гомологичной рекомбинации

К тому времени как я завершила работу над своей диссертацией на соискание степени доктора философии в конце 1980-х, направленное воздействие на гены широко применялось для редактирования ДНК в культурах клеток мышей и человека и даже в живых мышах. Важная работа, проведенная в лаборатории Мартина Эванса, продемонстрировала, что, направленно воздействуя на гены в эмбриональных стволовых клетках мышей и затем вводя эти измененные стволовые клетки обратно в мышиные эмбрионы, ученые могут создавать живых мышей с “дизайнерскими” изменениями. Важнейшие открытия, совершенные Капекки, Смитисом и Эвансом, впоследствии, в 2007 году, были удостоены Нобелевской премии по физиологии или медицине.

Впрочем, несмотря на свой колоссальный потенциал, редактирование генома поначалу больше подходило для фундаментальных исследований, чем для применения в лечении заболеваний у человека. Для ученых, исследующих генетику млекопитающих и пытающихся найти способы, которыми можно было бы выявить функции различных генов, метод направленного воздействия на гены в корне менял все. Однако исследователи-медики с настороженностью относились к использованию этого метода на людях, поскольку, несмотря на весь свой потенциал, гомологичная рекомбинация совсем не оправдывала ожиданий в том, что касалось лечения.

Возможно, самым важным сдерживающим фактором была проблема негомологичной (или незаконной) рекомбинации, при которой новая ДНК интегрируется в геном случайным образом, вместо того чтобы оказаться точно у подходящей последовательности. Фактически незаконная рекомбинация, похоже, происходила почти в сто раз чаще гомологичной, и, естественно, терапевтические перспективы технологии, которая могла исправить мутировавший ген лишь в 1 % измененных клеток, а в геном остальных 99 % “вклеивала” ДНК как попало, не выглядели слишком многообещающими. Ученые разрабатывали различные изящные пути обхода этой проблемы в клеточных культурах и не теряли надежду на то, что в будущем метод удастся применить в медицине. Как заявил Капекки в начале 1990-х, “в конце концов, гомологичная рекомбинация – единственный потенциально возможный метод генной терапии человека”[32]. Однако в то время казалось, что редактирование генома – просто недостаточно совершенная технология для того, чтобы применять ее на людях.

В начале 1980-х, пока другие ученые были поглощены мыслями о направленном воздействии на гены в клетках человека, Джек Шостак пытался разобраться в процессе клеточного деления у дрожжей. Шостак был профессором Гарвардской медицинской школы (и затем моим научным руководителем в работе над докторской диссертацией), и его занимал фундаментальный вопрос: как вообще возможны направленное воздействие на гены и гомологичная рекомбинация? В частности, Шостак хотел понять, каким образом две цепочки ДНК из одной хромосомы могут объединяться с двумя соответствующими цепочками ДНК из второй хромосомы, обмениваться информацией, слившись на время некой промежуточной стадии, и затем разделяться вновь, заново образуя отдельные хромосомы после деления клетки.

В 1983 году, когда я все еще была студенткой Помона-колледжа в Калифорнии, Шостак на другом конце страны решил, что нашел ответ. Основываясь на результатах экспериментов по генетике дрожжей, он и его магистрантка Терри Орр-Вивер вместе с профессорами Родни Ротштайном и Фрэнком Сталем обнародовали смелую модель[33], согласно которой провоцирующим фактором – сигналом, запускающим процесс гомологичной рекомбинации, – было разрезание одной из двух хромосом, что приводило к двуцепочечному разрыву ДНК. Согласно этой модели, двуцепочечный разрыв и освободившиеся концы ДНК на месте разрыва были особенно подвержены слиянию, а располагающиеся по бокам их последовательности с гораздо большей вероятностью могли быть вовлечены в обмен генетической информацией с соответствующей хромосомой (или, в случае редактирования генома, – с соответствующей ДНК, которую предоставлял исследователь).

К тому времени как я пришла в лабораторию Шостака в 1986 году, он уже сменил центральную повестку своих исследований на изучение роли молекул РНК на начальных этапах эволюции жизни на Земле. Однако в лаборатории мы с коллегами обсуждали модель двуцепочечных разрывов, ее изящество и тот неприкрытый скепсис, с которым она была встречена в научном сообществе. Но с течением времени становилось все яснее, что эта модель согласуется с большим количеством экспериментальных данных. Механизм репарации двуцепочечных разрывов казался логичным не только в случае процесса гомологичной рекомбинации при формировании яйцеклеток и сперматозоидов, но и при рекомбинации, происходящей каждый раз, когда была повреждена ДНК. Все клетки подвержены разрушительным для ДНК воздействиям, будь то рентгеновское излучение или канцерогены, и надо отметить, что клетки весьма эффективно справляются с репарацией таких разрывов, не теряя при этом генетической информации. Согласно модели Шостака, этот процесс репарации зависел от возможности хромосом обмениваться фрагментами посредством гомологичной рекомбинации, и именно поэтому наличие двух копий хромосом является выгодной эволюционной стратегией. Любое повреждение одной из хромосом можно репарировать, просто скопировав соответствующую последовательность со второй хромосомы.

Если модель двуцепочечных разрывов верна и выводы, полученные на дрожжах, справедливы и для млекопитающих, возникает очевидная возможность улучшить эффективность редактирования генома: сделать надрез в ДНК в точности в том месте, где необходимо провести редактирование. Если предстоит заменить дефектный ген в геноме на исправленную копию, созданную в лаборатории, то сначала нужно понять, как разрезать дефектный ген, вызвав локальный двуцепочечный разрыв в ДНК, – а затем добавить исправленную копию гена. Клетка, “почувствовав” разрыв, попыталась бы восстановить повреждение, начав поиск соответствующей хромосомы для копирования, – тут-то ученые и “подсунули” бы ей синтезированный ген. По сути дела, можно было заставить клетку “подумать”, что повреждение ее ДНК произошло по естественным причинам, и предоставить ей новый фрагмент ДНК под видом второй хромосомы, которую клетка могла бы использовать для репарации поврежденного участка.

В 1994 году исследователи из лаборатории Марии Джесин в Мемориальном онкологическом центре имени Слоуна – Кеттеринга (Нью-Йорк) стали первыми, кому удалось “обмануть” таким образом клетки млекопитающих, – об этом прорыве я читала с большим интересом, находясь неподалеку, в Нью-Хейвене, куда я только что приехала после завершения работы постдоком в Боулдере. Мне было чрезвычайно интересно узнать об этой важной работе, которая была основана на предложенной моим научным руководителем модели двуцепочечных разрывов и выполнена исследовательницей, которая, как и я, была увлечена молекулами жизни.

Эксперименты по редактированию генома, проведенные Джесин, были оригинальными и новаторскими. Ее стратегия заключалась в введении в мышиные клетки ферментов, разрезающих геном и создающих двуцепочечные разрывы; одновременно с этим она добавляла в клетки фрагменты синтезированной ДНК (шаблоны для репарации), соответствующие разрезанной последовательности ДНК. Затем исследовательница проверяла, получилось ли у мышиных клеток восстановить поврежденную ДНК с помощью вставки шаблона для репарации. Проводя этот же самый эксперимент с добавлением фермента и без него, Джесин смогла проверить свою гипотезу, что искусственно созданный двуцепочечный разрыв повышал эффективность гомологичной рекомбинации.

Сложность заключалась в том, чтобы подобрать подходящий фермент, разрезающий геном только в одном определенном месте из миллиардов возможных вариантов. Чтобы решить эту проблему, Джесин остроумно позаимствовала часть молекулярного механизма из дрожжей: эндонуклеазу I-SceI[34].

Нуклеазы – это ферменты, разрезающие нуклеиновые кислоты; одни режут РНК, другие – ДНК. Эндонуклеаза делает “надрез” где-то внутри цепочек, в отличие от экзонуклеаз, которые работают исключительно с концами цепочек. Некоторые эндонуклеазы чрезвычайно губительны для клеток, поскольку они “режут” практически любой фрагмент ДНК, который встречается им на пути, вне зависимости от последовательности нуклеотидов в нем. Другие эндонуклеазы действуют очень специфично и разрезают только строго определенные последовательности; а большинство ведет себя как нечто среднее между первыми и вторыми.

Эндонуклеаза I-SceI, которую выбрала Джесин, была одной из наиболее специфических эндонуклеаз, известных к тому времени: фрагмент ДНК должен был содержать определенную последовательность из восемнадцати нуклеотидов, чтобы фермент сделал в нем разрез. Использование высокоспецифичной эндонуклеазы было критически важно: если бы Джесин выбрала слишком “неразборчивый” фермент, он бы “порезал” геном как попало, и это не только сделало бы результаты более сложными для интерпретации, но и, вероятно, повредило бы клетку. Однако, обладая специфичностью к восемнадцатибуквенной последовательности ДНК, I-SceI разрезает только один фрагмент ДНК из более чем пятидесяти миллиардов возможных комбинаций. (По иронии судьбы, в мышином геноме нет подходящей последовательности из восемнадцати “букв”, поэтому, прежде чем приступить к своему эксперименту, Джесин пришлось добавить копию этой последовательности в ДНК мышей – чтобы ферменту было что резать.)

Результаты эксперимента Джесин[35] были потрясающими. Она добилась того, что точная репарация мутировавшего гена посредством гомологичной рекомбинации прошла в целых 10 % клеток; сейчас эта эффективность может показаться не слишком высокой, однако это было в сотни раз лучше, чем у лучших из достигнутых к тому времени результатов. На тот момент это было наиболее многообещающее свидетельство того, что гомологичная рекомбинация может рано или поздно позволить ученым переписывать генетический код без риска незаконной рекомбинации или риска случайного встраивания в геном различных последовательностей при использовании ретровирусных векторов. Стоит лишь инициировать двуцепочечный разрыв в нужном месте – и фактически все остальное клетки сделают сами.

Имелась только одна проблема: чтобы этот подход можно было практически использовать, нужно было научиться разрезать геном в строго заданных местах. В эксперименте Джесин для проверки правильности идеи последовательность, которую распознавала эндонуклеаза I-SceI, была искусственно добавлена в геном перед введением нуклеазы, однако последовательности многих болезнетворных генов, скажем так, незыблемы: их невозможно изменить таким образом, чтобы они “пришлись по вкусу” тому или иному придирчивому ферменту. После разрыва геном легко восстанавливался и включал в себя новую генетическую информацию – хитрость была в том, чтобы понять, как сделать разрыв в нужном месте.

Начиная с середины 1990-х, пока я разбиралась со структурами молекул РНК с их уникальным биохимическим поведением, другие ученые спешили разработать новые системы, которые, подобно I-SceI, могли бы направленно действовать на конкретные последовательности ДНК. Тот, кому удалось бы решить эту проблему, смог бы раскрыть весь потенциал редактирования генома.

К этим технологиям нового поколения предъявлялось три критически важных требования: они должны были распознавать определенную выбранную последовательность ДНК; уметь разрезать эту последовательность и легко подвергаться перепрограммированию, для того чтобы атаковать различные последовательности ДНК и инициировать их разрыв. Первые два условия были необходимы для создания двуцепочечных разрывов, а третье – для того, чтобы этот инструмент был максимально универсален. I-SceI превосходно отвечала двум первым критериям, однако совершенно не соответствовала третьему. Биоинженеры поняли: чтобы создать программируемую систему разрезания ДНК, нужно либо перестроить I-SceI таким образом, чтобы она могла атаковать разные последовательности, либо найти совершенно новую нуклеазу, которая уже “научилась” разрезать самые различные последовательности ДНК.

Попытки ученых видоизменить I-SceI не достигли цели (что и неудивительно, учитывая крайне сложное молекулярное устройство белков-ферментов), и вскоре стало ясно, что поиск других природных нуклеаз – гораздо более перспективный подход. Фактически, к тому моменту, когда Джесин вела свои эксперименты с I-SceI, ученые уже выделили десятки нуклеаз из целого ряда организмов и установили конкретные последовательности ДНК, служившие мишенями для этих ферментов. Однако существовала фундаментальная проблема: подавляющее большинство ферментов распознавали последовательности длиной лишь в 6 или 8 “букв” – то есть слишком короткие для того, чтобы с таким ферментом можно было работать. В геноме человека подобные последовательности встречаются десятки или даже сотни тысяч раз, и это означает, что, даже если нуклеаза способна стимулировать гомологичную рекомбинацию в одном гене, она в процессе может “порубить” почти весь геном. Клетка была бы разрушена еще до того, как у нее появится какой-либо шанс начать репарацию ДНК.

Исследователи не могли положиться ни на одну из ранее открытых нуклеаз, а поиск нового фермента, подобного I-SceI, для каждой новой попытки редактирования генома – задача совершенно неосуществимая. Если вы хотите превратить терапевтическое редактирование генома в эффективную технологию исправления болезнетворных мутаций, то медики не могут в каждом случае ждать, пока вы обнаружите нуклеазу, которая бы избирательно действовала именно на тот участок заданного гена, в котором у конкретного пациента вредоносная мутация. Вам необходима возможность “взять с полки” подходящую нуклеазу из уже открытых – или по крайней мере технология, позволяющая создавать нужные нуклеазы по мере необходимости.

Революционное исследование, предложившее решение этой проблемы, было проведено в 1996 году, хотя я тогда о нем не знала. Шринивасан Чандрасекаран, профессор из Университета Джонса Хопкинса, понял, что вместо создания нуклеаз “с нуля”, поиска новых в природе или переделывания I-SceI можно избрать смешанный подход: выбирать фрагменты существующих белков и комбинировать их. Такие химерные нуклеазы отвечали бы двум первым требованиям к редактирующей геном нуклеазе: они были бы способны распознавать определенную выбранную последовательность ДНК и делать в ней разрез.

Чандрасекаран решил собрать химерную нуклеазу из фрагментов двух встречающихся в природе белков, которые отлично справлялись с распознаванием и разрезанием последовательностей ДНК соответственно. Для разрезания Чандрасекаран выбрал участок бактериальной нуклеазы под названием FokI, который мог инициировать разрывы в ДНК, но не обладал предпочтениями к каким-либо последовательностям. А для “нацеливания” он приспособил повсеместно распространенные натуральные белки с цинковыми пальцами (ZFN), названные так потому, что они распознают ДНК, используя похожие на пальцы структуры, связанные ионами цинка и расположенные рядом друг с другом подобно пальцам на руке. Так как эти белки с цинковыми пальцами состоят из многократно повторяющихся, тандемно расположенных участков и каждый участок распознает определенную последовательность из трех “букв” ДНК, казалось вероятным, что ученые могут видоизменить эти белки, комбинируя фрагменты по-разному, чтобы они распознавали различные последовательности ДНК.

Удивительно, но химерная нуклеаза, судя по всему, сработала[36]. Соединив “режущий” фрагмент FokI с распознающим ДНК участком белка с цинковыми пальцами, команда Чандрасекарана продемонстрировала, что искусственно составленная нуклеаза распознавала и резала именно ту ДНК, что ожидали ученые, – даже несмотря на то, что они смешали два белковых компонента из совершенно различных источников.

Вскоре Чандрасекаран пригласил к сотрудничеству профессора университета Юты Дану Кэрролл, чтобы использовать эти новые нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) в более прикладных целях. Вместе они продемонстрировали, что ZFN работают и в яйцеклетках лягушки[37] (популярной среди биологов модельной системе) и что сделанные ZFN разрывы в ДНК стимулировали гомологичную рекомбинацию. Затем, работая с плодовыми мушками, сотрудники лаборатории Даны Кэрролл сумели запрограммировать новую ZFN на направленное воздействие на ген yellow (один из генов, определяющих окраску тела) и показали, что эта стратегия может обеспечить заданное генетическое изменение во всем организме[38]. Это был очень важный шаг в развитии редактирования генома. ZFN проявили себя не только подходящими для применения в организмах животных; что более важно, их оказалось можно видоизменить таким образом, чтобы их мишенями стали другие, новые гены.

Научное сообщество вскоре подхватило эстафету, и исследователи начали разрабатывать ZFN под собственные цели, выбирая в качестве мишеней новые гены и работая с новыми модельными объектами. В 2003 году Мэттью Портеус и Дэвид Балтимор первыми показали: ген в клетке человека можно редактировать с высокой точностью, используя специально созданную ZFN[39]. Вскоре после этого Федор Урнов и его коллеги исправили в клетках человека мутацию, вызывающую сцепленный с X-хромосомой ТКИД[40]. Возможности использования редактирования генома для направленного воздействия на наследственные заболевания еще никогда не казались настолько близкими к реальности.

Тем временем ZFN также начали использовать в лабораториях, которым редактирование генома было необходимо совсем для других целей – например, создания “дизайнерских” злаков или животных моделей. В конце 2000-х технологию успешно применили к резуховидке Таля, табаку и кукурузе, показав, что двуцепочечные разрывы ДНК способствуют высокоэффективной гомологичной рекомбинации во многих типах клеток, а не только в клетках млекопитающих. В это же время стали появляться публикации, в которых рассказывалось об использовании ZFN для изменения генов у пресноводных лучеперых рыб данио-рерио, червей, крыс и мышей. Это направление работы выглядело интригующе и неизменно привлекало мое внимание – и в научных статьях, и на конференциях. Его потенциал казался чрезвычайно мощным.

Однако, несмотря на свою кажущуюся перспективность, белки ZFN никогда не применялись широко за пределами небольшого числа лабораторий. Исследователи, использовавшие эти нуклеазы, либо сами обладали громадным опытом в области белковой инженерии, либо сотрудничали с теми немногими лабораториями, в которых подобные эксперименты уже проводились, либо могли позволить себе платить баснословные деньги за нуклеазы, сконструированные на заказ. В теории создание ZFN было простым: нужно было просто соединить различные фрагменты белков с цинковыми пальцами, чтобы они распознавали последовательность ДНК, которую исследователь желает отредактировать. Однако на практике это было очень сложно. Большая доля создаваемых ZFN попросту не распознавали те последовательности ДНК, которые должны были распознавать; другие были слишком неразборчивы и воздействовали на первые попавшиеся участки ДНК, лишь отдаленно похожие на целевые, и убивали клетки, геном которых должны были отредактировать. В других случаях фрагмент с цинковыми пальцами успешно распознавал ДНК, однако нуклеазный фрагмент не разрезал ее.

Подобно тому как изменение I-SceI оказалось слишком сложной задачей, так и ZFN тоже, как выяснилось, было нелегко перепрограммировать, чтобы использовать в качестве универсального инструмента редактирования генома. Конечно, результаты экспериментов с ZFN убедительно доказали, что специально видоизмененные нуклеазы полезны, если редактирование генома – самоцель, однако в этой области науки все еще нужна была новая технология, более надежная и простая в использовании.

Такая технология – или, по крайней мере, первая ее версия – была открыта в 2009 году при изучении новых типов белков, найденных в патогенных бактериях рода Xanthomonas, поражающих растения. Эти белки, которые были названы активатороподобными эффекторами транскрипции (transcription activator – like effectors, TALE), были удивительно похожи по своему строению на белки с цинковыми пальцами: они состоят из многократно повторяющихся фрагментов, и каждый фрагмент распознает определенную область ДНК. Однако от белков ZNF их отличала важная деталь: в то время как каждый “палец” в последних распознает трехбуквенную последовательность ДНК, каждый фрагмент TALE-белков узнает всего одну “букву” ДНК. Это различие позволило ученым легко определить закономерность, по которой фрагмент будет распознавать определенную “букву” ДНК, и затем они просто расположили эти фрагменты один за другим таким образом, чтобы они распознавали более длинную последовательность ДНК в гене. В случае ZFN это лишь казалось легко сделать, однако с TALE процедура в самом деле была простой.

Ученые быстро взялись за исследование новейшей “зацепки”. Вскоре после того, как был расшифрован этот код, три лаборатории соединили белки TALE с теми же режущими ДНК фрагментами, что есть в ZFN, и создали нуклеазы TALE, или TALEN. TALE-нуклеазы были очень эффективны для инициации редактирования генома внутри клеток, и после того как удалось еще несколько усовершенствовать их строение, стало очень похоже на то, что TALEN будет гораздо проще создавать и применять, чем ZFN.

“Но как жаль бедняжек TALEN”[41], – писала Дана Кэрролл в статье, описывающей историю появления редактирования генома. Потому что, как только TALEN обнаружили и адаптировали для редактирования, их вытеснило следующее, и возможно последнее, открытие в области редактирования генома. Эта технология получила название CRISPR, и здесь моя история соединяется с историей редактирования генома – и вообще с этим длинным маршем истории науки, которая в тот момент подошла к порогу новой головокружительной эры.

Глава 2

Новая защита

В 2014 году я отметила двадцатилетие своей исследовательской лаборатории (и заодно мое пятидесятилетие) выездом сотрудников в места моего детства: на Гавайи. Около тридцати участников празднования (сборная солянка из студентов, аспирантов, постдоков, технических работников и близких, в числе которых оказался даже мой сын Эндрю) оккупировали три арендованных домика рядом с городом Кона на западном берегу Большого острова – всего в пятнадцати минутах от пляжа и нескольких часах езды от дома в Хило, в котором прошло мое детство. Днем мы устраивали пикники, бродили по Гавайскому вулканическому национальному парку, отправлялись на ближайшие пляжи или рынки и плавали с маской и трубкой среди нетронутых коралловых рифов, окружающих остров. Мы провели незабываемый вечер, наслаждаясь захватывающими видами красноватых отсветов от потоков лавы из кратера Халемаумау, а в другие вечера устраивали непринужденные вечеринки на задних двориках наших домов: общение, пицца и пиво, спонтанные танцы и караоке.

Конечно, как и на любом научном сборище, часть времени была посвящена выступлениям. За четыре дня мы провели четыре мини-симпозиума, на которых каждый сотрудник сделал пятнадцатиминутный доклад на выбранную им самим тему – от истории лаборатории до тонкостей структуры РНК.

На четвертый день постдок Росс Уилсон, взявший на себя большую часть забот по организации нашего путешествия, встал, чтобы прочесть последний доклад. Точнее, я думала, что это будет доклад. Но вместо этого Росс сделал нам сюрприз, показав короткий фильм, смонтированный из фрагментов видео, в которых фигурировала я сама. Оказывается – и я ничего об этом не знала! – коробка со старыми VHS-кассетами все эти годы передавалась от одного поколения сотрудников к другому: своего рода традиция лаборатории.

Гости то издавали одобрительные возгласы, то подтрунивали надо мной, пока один кадр на экране сменялся другим: вот я выступаю с благодарственной речью на церемонии награждения премией Национального научного фонда в 1999-м, вот мое фото со счетчиком Гейгера в руках в одном из номеров Vogue за 2000 год, а вот и отрывок из документального фильма, который Фредерик Уайзман снимал в моей лаборатории, к тому моменту переместившейся из Йельского университета в Калифорнийский университет в Беркли.

В этой нарезке оказались и фрагменты из двух новостных сюжетов, в которых я в свое время появлялась, и в обоих шла речь о первом крупном открытии, сделанном в моей лаборатории в Йеле в 1996 году. Я помнила о существовании этих видео, помнила даже кое-какие детали их содержания. В то время внезапный всплеск внимания к моей работе меня одновременно и радовал, и немного нервировал – ведь я тогда была молодой исследовательницей, проводившей большую часть времени за рабочим столом, в уединении своей лаборатории.

Из всех эпизодов в фильме Росса эти два вызвали самую бурную реакцию. Они казались такими безнадежно древними: начальнице всего около тридцати, ведущие выглядят и говорят старомодно, и в кадре видны громоздкие допотопные компьютеры, которые в то время, конечно, были последним словом техники.

Пока я веселилась вместе со всеми остальными, память уносила меня в те ранние годы моей работы в Йеле, и я вновь ощутила те надежды и страхи, которые испытала, когда двинулась в новую рискованную область исследований, начала работу над проектом, из которого, как предостерегали меня многие коллеги-ученые, никогда ничего не получится. Глядя теперь на то, как я в молодости отвечала на вопросы интервьюеров, я живо вспомнила и воодушевление, и ощущение тяжелой утраты – главные чувства, сопровождавшие меня в те годы. Мои тогдашние комментарии оказались на удивление точным предсказанием того, что произошло значительно позднее, по мере того как разворачивались мои исследования по новым направлениям.

Во времена, когда я давала эти интервью, моя лаборатория только что установила трехмерную структуру – точное расположение каждого атома – в молекуле рибонуклеиновой кислоты (РНК), образующей часть более крупной молекулы под названием самосплайсирующий рибозим. В 1980-х годах Том Чек, мой научный руководитель в Университете штата Колорадо в Боулдере, получил Нобелевскую премию за обнаружение самосплайсирующих рибозимов[42]. Его открытие было прорывом, поскольку существование самосплайсирующих рибозимов предполагает, что жизнь на Земле могла возникнуть из молекул РНК, способных и кодировать генетическую информацию, и копировать ее в примитивных клетках. Когда в 1994 году я возглавила собственную лабораторию в Йеле, я собиралась отталкиваться в своей работе от открытия Тома – изучить структуру рибозимов, чтобы лучше понять, как они работают. Я хотела определить, каким образом РНК – молекула, тесно связанная с ДНК, – может функционировать и в качестве хранилища генетических инструкций, и в качестве химически активной молекулы, способной изменять свою форму и биологическое “поведение”. Кульминацией этого исследования стало фантастически волнующее открытие: молекулы РНК могут складываться в трехмерные структуры, совершенно непохожие на изящную в своей простоте двойную спираль ДНК.

Однако моя радость от установления структуры рибозимов – эту работу я провела вместе со своим аспирантом Джейми Кейтом – омрачилась личной трагедией. Той осенью отец позвонил мне на работу в Йель, чтобы сообщить ужасную новость: ему диагностировали меланому на поздней стадии. В последние три месяца его жизни я трижды летала из Нью-Хейвена на Гавайи, чтобы подержать его за руку, почитать ему вслух его любимые отрывки из “Уолдена” Генри Торо, вместе послушать Моцарта, обсудить, как действуют различные обезболивающие и что происходит с нами после смерти. Это были крайне напряженные дни и ночи.

Папа всегда интересовался моими исследованиями и во время каждой встречи расспрашивал меня, что нового в лаборатории. Однажды я показала ему рисунок молекулы рибозима, сделанный зелеными чернилами. “Похоже на зеленые фетучини!” – сказал он. Через три недели его не стало.

Потрясенная смертью отца и желая отвлечься, я с головой окунулась в работу, утешаясь мыслью, что однажды наша работа спасет или хотя бы улучшит жизни людей. Рибозимный проект, как и многие другие научные исследования, двигали два желания: пролить свет на неизведанные явления природы и использовать полученные знания на практике. В то время, когда я решила установить молекулярную структуру рибозимов, многие биологи думали, что молекулы этого типа лягут в основу альтернативного способа лечения ряда заболеваний. Основанный на рибозимах метод терапии, каким его представляли тогда, отличался и от генной терапии (которая была нацелена на исправление генетических проблем путем добавления здоровых генов), и от редактирования генома (направленного на “починку” самих дефектных генов) тем, что позволял врачам лечить пациентов, “ремонтируя” бракованные молекулы РНК – переносчики сигналов, используемых клетками для перевода информации с ДНК в белки.

Окрыленная успехом нашего исследования рибозимов, я высказала в телевизионном эфире идею, что эти молекулы однажды станут инструментами для редактирования ДНК. В конце концов, уже в то время имелось несколько свидетельств тому, что некоторые рибозимы способны запускать химические изменения в ДНК. Пересматривая эти кадры спустя столько лет, я видела себя двадцатилетней давности, объясняющую, зачем вообще нужен рибозимный проект:

Одна из потенциальных возможностей заключается в том, что мы сможем избавлять людей от генетических нарушений или облегчать состояние пациентов с такими нарушениями… Мы надеемся, что [это открытие] подскажет нам, каким образом мы можем модифицировать рибозимы для того, чтобы они работали в качестве ремонтных наборов для молекул и исправляли дефектные гены.

В конце концов эта идея так и не воплотилась в жизнь – по крайней мере, к настоящему моменту. Хотя несколько вариантов терапии, основанной на рибозимах, в конце концов дошли до стадии клинических испытаний, эффективность в лечении генетических заболеваний не была доказана ни для одного из них. Однако это интервью из далекого прошлого резко вернуло меня к настоящему – оно было неожиданным образом связано с моим текущим исследованием.

Что привлекло мое наибольшее внимание в этих старых кадрах, так это слова, которые я выбирала для интервью: они отразили неожиданный поворот в направлении моей научной работы. Когда я описывала наше исследование рибозимов с точки зрения его потенциального применения для исправления генов, у меня и мысли не было о том, что почти двадцать лет спустя редактирование генома будет определять ход моей карьеры.

Примерно через пятнадцать лет после того, как эти телесюжеты вышли в эфир, я погрузилась в область исследований, потенциальная терапевтическая польза от которых была гораздо, гораздо больше, чем я могла себе представить в 1996-м, едва только став самостоятельным исследователем. Это произошло в момент, когда я изучала другую биологическую систему – иммунную систему бактерий, где РНК играла главную роль. Но в отличие от рибозимного проекта, который был посвящен теме, уже оказавшейся в центре внимания из-за Нобелевской премии, которой наградили открывателя рибозимов, это научное путешествие начиналось в полной безвестности: его затеяли чуть ли не ради забавы, и проект продвигался благодаря почти невероятным (но оказавшимся крайне полезными) встречам и столь же случайным, но плодотворным научным коллаборациям. Теперь, сидя в окружении своей семьи и коллег и глядя на экран, на котором блистала молодая версия меня самой, я удивлялась и радовалась тому, как наглядно идея, лежащая в основе моей работы, – исправление дефектных генов – пронизывает насквозь всю мою карьеру.

Я никогда не забуду, как впервые услышала термин CRISPR.

Однажды в 2006 году, когда я сидела у себя в кабинете на седьмом этаже Стэнли-холла в Калифорнийском университете в Беркли, зазвонил телефон. На проводе была Джиллиан Бэнфилд, коллега-профессор с кафедры наук о Земле и планетологии, а также с кафедры наук об окружающей среде, экологической политики и природопользования.

Я знала о Джилл только понаслышке, и она обо мне тоже; она объяснила, что нашла сайт моей лаборатории, только потратив некоторое время на его поиск в Google. Геомикробиолог, сосредоточенный в первую очередь на взаимоотношениях микроорганизмов с их окружающей средой, Джилл искала среди сотрудников Беркли исследователей, которые бы занимались РНК-интерференцией – системой процессов на молекулярном уровне, которую клетки животных и растений используют для подавления экспрессии конкретных генов; на уровне целого организма эта система задействуется во время иммунных ответов. По этой теме у нашей лаборатории имелся обширный опыт.

Джилл рассказала мне, что ее лаборатория занимается изучением чего-то, что я на слух восприняла как “криспер[43], – она не объяснила, о чем речь, и даже не произнесла слово по буквам, лишь упомянула, что это название “всплыло” в каких-то наборах данных, которые анализировали ее сотрудники, – и что она хочет расширить область исследования, используя методы генетики и биохимии: именно такие инструменты могла бы предоставить моя лаборатория. В частности, Джилл считала, что между “криспером” и РНК-интерференцией могут быть некоторые параллели. Не хочу ли я встретиться и обсудить это?

Я была заинтригована напором Джилл, хотя и сомневалась насчет ее запроса; я так и не поняла, что именно она исследует. Но ее энтузиазм чувствовался даже по телефону, так что я согласилась выпить с ней чашечку кофе на следующей неделе.

После этого звонка я сделала беглый поиск по базам научных публикаций и нашла лишь несколько статей, посвященных теме, о которой с таким воодушевлением рассказывала Джилл. Для сравнения: РНК-интерференция, изучение которой началось всего-то восемь лет, упоминалась в тот момент уже более чем в четырех тысячах источников (внимание к этой теме достигло апогея, когда позднее в том же году открыватели РНК-интерференции Эндрю Файер и Крейг Мелло получили Нобелевскую премию). Из-за нехватки публикаций было трудно оценить важность темы, о которой говорила Джилл, – но именно это подстегнуло мое любопытство.

Я пробежалась глазами по нескольким обзорным статьям и прочла ровно столько, чтобы понять: эта штука – CRISPR – обозначает участок бактериальной ДНК, а сокращение расшифровывается как “кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками, clustered regularly interspaced short palindromic repeats”. Дальше я разбираться не стала, увязнув в незнакомых терминах, и решила, что Джилл расскажет мне подробности при встрече.

Поиск информации о Джиллиан в Google показал, что она чрезвычайно успешный ученый. Яркая, предложившая неожиданные идеи во множестве самых разных областей науки, она опубликовала статьи с такими заголовками, как “Минералогические следы живого и поиск жизни на Марсе” (Mineralogical Biosignatures and the Search for Life on Mars) и “Геофизическая визуализация стимулированной микробной биоминерализации” (Geophysical Imaging of Stimulated Microbial Biomineralization). Ее исследования включали в себя сбор и изучение биологических образцов, собранных со всего света: от горных пород, слагающих земную кору под Японией, до гиперсоленых озер Австралии и закисленных водоотливов в Северной Калифорнии. Эти экзотические работы разительно контрастировали с моими: если не считать неизбежно частых визитов в Национальную лабораторию имени Лоуренса в Беркли для исследований на циклотроне, эксперименты в моей лаборатории проводились по большей части в пробирках.

Частично из-за того, что меня так впечатлили исследованияя Джилл, частично из моих собственных научных интересов я все больше хотела с ней встретиться. За четыре года до этого я перешла из Йельского университета в Беркли и переехала в Калифорнию вместе с Джейми Кейтом, который теперь стал моим мужем, и нашим новорожденным сыном Эндрю. Хотя мои текущие исследования уже развивались в некоторых новых направлениях, я надеялась расширить лабораторию и запустить в ней несколько дополнительных проектов, одновременно наладив рабочие связи с новыми коллегами. Возможно, сотрудничество с Джилл – это именно то, чего я ищу.

Мы с Джилл встретились на следующей неделе в кафе Free Speech Movement недалеко от входа в одну из студенческих библиотек кампуса. Был ветреный весенний день, и, когда я пришла в кафе, Джилл уже расположилась во внутреннем дворике, за одним из мраморных столиков. На столе лежали блокнот и стопка бумаги. Мы немного поболтали, а затем Джилл открыла блокнот и перешла к делу.

Она быстро набросала схему CRISPR. Сначала изобразила большой овал, он обозначал бактериальную клетку. Затем внутри овала нарисовала круг – бактериальную хромосому, а на одной из его сторон – чередующиеся квадратики и ромбики, символизирующие конкретный участок ДНК. Этот участок, очевидно, и представлял собой CRISPR.

Джилл заштриховала ромбики и объяснила, что все они представляют собой одинаковые последовательности примерно из тридцати “букв” ДНК. Затем она последовательно пронумеровала квадратики, начиная с цифры 1, и сказала, что каждый из них включает в себя уникальную последовательность ДНК.

Наконец я начала понимать слова, скрывавшиеся за аббревиатурой CRISPR: кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками. Ромбики были короткими повторами, а квадратики – регулярными промежутками, которые их разделяли, и эти последовательности ромбиков и квадратиков были сгруппированы в кластеры на одном участке хромосомы, а не разбросаны по ней. Уже потом, когда я более детально ознакомилась с повторяющимися последовательностями ДНК в своем рабочем кабинете, значение буквы “P” в аббревиатуре тоже стало мне понятным: последовательности при чтении их в противоположных направлениях “звучали” практически одинаково – словно палиндром вроде “нажал кабан на баклажан”[44].

Сама идея, что клетки могут нести в себе повторяющиеся последовательности ДНК, не нова: более 50 процентов генома человека – существенно больше миллиарда “букв” ДНК – это различные типы повторяющихся последовательностей, и некоторые из них представлены миллионами копий. Хотя геномы бактерий сравнительно небольшие, они тоже содержат повторяющиеся последовательности. Я знала о нескольких типах, в названии которых даже присутствовали некоторые слова из расшифровки CRISPR: повторяющиеся экстрагенные палиндромы (REP) и бактериальная, рассеянная по геному, повторяющаяся ДНК (BIME). Но я никогда раньше не слышала о последовательностях ДНК, повторяющихся так точно и настолько унифицированных, чтобы все повторы действительно совпадали друг с другом и всегда были отделены от соседей последовательностями-спейсерами близкой длины, но со случайным набором нуклеотидов.

Желая узнать больше об этих странных участках бактериальной ДНК, я спросила Джилл, каковы их биологические функции, но, к моему разочарованию, Джилл ответила, что ничего об этом не знает. Однако в ее лаборатории обнаружили важную зацепку[45]. Последовательности ДНК бактерий природных популяций показали, что буквально каждая клетка в них содержит уникальный вариант CRISPR, поскольку разделяющие регулярные повторы промежутки у каждой клетки отличаются. Это было совершенно необычно, поскольку все остальные участки ДНК у этих клеток практически совпадали. Джилл поняла, что CRISPR, скорее всего, эволюционируют быстрее всех остальных областей генома, а это указывает на то, что их функция – быстро меняться или адаптироваться в ответ на некий вызов из внешней среды, с которым сталкиваются клетки.

CRISPR внутри бактериальной клетки

Годами ранее испанский профессор Франсиско Мохика в своей новаторской работе[46] обнаружил те же повторы у множества совершенно не родственных друг другу видов, включая архей – одноклеточных организмов, которые, как и бактерии, не имеют ядер. (Бактерии, археи – их собирательное название “прокариоты” – и эукариоты представляют собой три домена, включающих все формы жизни на Земле.) CRISPR, по словам Джилл, обнаружили в половине бактериальных геномов, секвенированных на тот момент, и почти во всех геномах архей. Выходило, что кластерные палиндромы – наиболее распространенный тип повторяющихся последовательностей ДНК у всех прокариот.

Эти факты заставили меня буквально задрожать от любопытства: если CRISPR присутствует у такого большого количества видов, то с высокой вероятностью природа использует этот инструмент для чего-то важного.

Я внимательно слушала, а тем временем Джилл вытащила из стопки бумаг три статьи, все 2005 года[47], и оживленно пересказала их суть. Три коллектива исследователей (один из них – под руководством Мохики) независимо друг от друга обнаружили, что многие спейсеры CRISPR – те фрагменты ДНК, что встроены между повторяющимися последовательностями, – точно совпадают с ДНК известных бактериофагов. Что еще интереснее, возникало ощущение, что между числом последовательностей ДНК в бактериальной CRISPR, совпадающей с вирусной ДНК, и числом вирусов, способных поразить эту бактерию, существует обратная зависимость: чем больше совпадений, тем ниже вероятность инфицирования. Собственное новаторское исследование Джилл[48], в котором геномы целых микробных сообществ были восстановлены секвенированием небольших, перекрывающих друг друга фрагментов ДНК и их сборкой в одну более длинную последовательность, также показало, что многие разделенные регулярными промежутками последовательности на содержащем CRISPR участке хромосомы соответствовали последовательностям вирусной ДНК, обнаруженным в окружающей бактериальные сообщества среде.

В совокупности эти новые сведения стали отличной подсказкой для ответа на вопрос, какую роль CRISPR играет у бактерий и архей. Авторы упомянутых статей обнаружили свидетельство в пользу того, что CRISPR, вероятно, является частью иммунной системы прокариот – адаптацией, позволяющей микроорганизмам успешно справляться с вирусами.

Напоследок, в качестве последнего козыря, Джилл выложила на стол самую новую статью о CRISPR. Опубликованная коллективом исследователей из Национальных институтов здравоохранения под руководством Киры Макаровой и Евгения Кунина[49], она называлась “Гипотетическая иммунная система прокариот, основанная на РНК-интерференции” (A Putative RNA-Interference-Based Immune System in Prokaryotes). Этот заголовок моментально привлек мое внимание. Хотя в этой статье, как и в трех предыдущих, явно недоставало убедительных экспериментальных данных, ее авторы проделали значительную работу, собрав всю доступную информацию о CRISPR. Сопоставив результаты множества более ранних исследований с экспертной оценкой распространения CRISPR у различных видов, они собрали из этих кусочков заманчивую новую гипотезу о том, что РНК служит ключевой составляющей иммунной системы одноклеточных организмов, таких как бактерии, и что эта система может быть функционально сходной с одним из объектов моих исследований, РНК-интерференцией.

Джилл не смогла бы найти лучшей приманки, чтобы завлечь меня в свои исследования. Не только вся моя научная деятельность до того момента была посвящена изучению молекул РНК, но я еще все больше концентрировалась на процессах РНК-интерференции в человеческих клетках. А тут еще Макарова и Кунин предполагали, что CRISPR представляет собой бактериальный аналог РНК-интерференции. Если это было верно, то моя лаборатория отлично подходит для того, чтобы разобраться с этим новым загадочным биологическим явлением. А перспективы были более чем соблазнительными, поскольку никто еще не провел экспериментов для подтверждения или опровержения теорий о биологическом смысле CRISPR – все только и делали, что плодили эти теории. Для биохимиков, таких как я, это был идеальный момент, чтобы ввязаться в борьбу за понимание того, как работает и для чего нужен CRISPR.

В завершение встречи с Джилл я поблагодарила ее и пообещала быть на связи. Мне нужно было переварить всю новую информацию и просчитать плюсы и минусы добавления исследований CRISPR к текущим проектам моей лаборатории. Если я соглашаюсь заниматься этой темой, мне понадобится ученый, постоянно занятый координацией работы по ней, так как у меня самой не хватило бы времени возглавить новый проект: я была слишком занята руководством лабораторией в целом.

Мне также нужно было освежить свои знания о мире бактерий и о вирусах, которые поражают эти бактерии. Я опубликовала немало научных статей о вирусе гепатита С, я изучала вирус гриппа с новым постдоком в собственной лаборатории, и я знала, что механизм РНК-интерференции тесно связан с противовирусной защитой растений и животных. Но я никогда не изучала вирусы бактерий и даже не особенно задумывалась о них. Если я собираюсь присоединиться к исследованиям Джилл, это положение дел нужно было менять.

Фредерик Туорт, британский бактериолог, работавший в начале XX века, стал первым ученым, отметившим действие бактериальных вирусов. По иронии судьбы, изначально Туорт собирался исследовать не вирусы бактерий, а вирусы, поражающие животных и растения, – а они были открыты уже давно. Однако в ходе попыток извлечь вирусы из таких субстратов, как навоз и сено, а затем культивировать их, Туорт обнаружил странную колонию бактерий из рода Micrococcus. Складывалось ощущение, что бактерии больны; вместо того чтобы, как большинство других бактерий, плотными колониями расти на питательной среде в чашках Петри, их культуры выглядели водянистыми и прозрачными. Если Туорт брал мазок с водянистой колонии микрококков и переносил его на здоровую, последняя через какое-то время тоже приобретала стеклянистый вид, словно ее чем-то заразили. Туорт написал статью, в которой предположил, что инфекционный агент в данном случае имеет вирусную природу, но идея о том, что вирусы способны заражать бактерии, в то время казалась неслыханной, а у перемен, произошедших с культурами, могли быть и другие объяснения. Ученый не мог с полной уверенностью говорить, что конкретно поразило здоровые культуры.

В 1917 году, спустя два года после публикации статьи Туорта, вирусы бактерий заново открыл канадский врач Феликс д’Эрелль. Во время Первой мировой войны д’Эрелль служил во Франции, и ему поручили расследовать причину вспышки дизентерии, которая косила солдат одного из кавалерийских эскадронов. Стремясь выяснить, почему одни больные выздоравливают, а другие нет, д’Эрелль взял у пациентов образцы кала и подверг их обстоятельному, хотя и достаточно грубому анализу. Сначала он пропустил кровянистый стул своих подопечных через мелкоячеистый фильтр, чтобы удалить из него все твердые частицы – включая бактерии. Затем д’Эрелль налил немного отфильтрованной жидкости на культуры бактерий рода Shigella, вызывающих дизентерию. На следующий день он с удивлением обнаружил, что одна из культур заразных бактерий под фекальной жидкостью “растворилась подобно сахару в воде” – исчезла буквально за ночь[50]. Что еще интереснее, когда д’Эрелль поспешил в госпиталь узнать о состоянии пациента, у которого был взят этот образец кала, он обнаружил, что больному заметно лучше. Сопоставив эти факты, д’Эрелль заключил, что возбудителя дизентерии уничтожил некий паразит, которого ученый назвал бактериофагом (“пожирателем бактерий”); эта форма жизни должна была быть достаточно маленького размера, чтобы пройти через фильтр. Судя по всему, “бактериофаг” заражал бактерии фактически так же, как другие вирусы инфицировали растения или животных.

В последующие годы было открыто множество бактериофагов, или, сокращенно, фагов, и выяснилось, что каждый из них поражает свой конкретный вид бактерий. По мере накопления знаний о новых разновидностях фагов увеличивался ажиотаж вокруг так называемой фаговой терапии – идеи о том, что бактериофагов можно использовать для лечения микробных инфекций. Хотя некоторым ученым претила идея вводить живые вирусы в организм человека, клинические испытания показывали, что фаги “не замечают” человеческие клетки и видимых побочных эффектов у фаговой терапии нет. В 1923 году д’Эрелль помогал советским ученым организовать институт в Тбилиси[51], исследования в котором были посвящены бактериофагам; во времена своего расцвета учреждение насчитывало более тысячи сотрудников, производящих тонны фагов в год для клинического использования[52]. В некоторых уголках мира фаговую терапию используют и по сей день – в Грузии в настоящее время фаги назначают при бактериальных инфекциях примерно в 20 процентах случаев[53]. Однако после того как в 1930-х были открыты антибиотики (а в 1940-х началось их массовое производство), этот способ терапии был быстро забыт, особенно на Западе.

Хотя бактериофаги нашли лишь ограниченное применение в медицине, для генетиков они стали настоящим подарком судьбы. К тому моменту, когда ученые с помощью новых электронных микроскопов с большим увеличением смогли впервые увидеть фагов (это случилось в 1940–1950-е годы), эти вирусы вкупе с бактериями-жертвами уже предоставили очередное доказательство дарвиновской теории естественного отбора. Они помогли установить, что именно ДНК, а не белки, служит “молекулой наследственности” в клетках. Тот факт, что генетический код триплетен (то есть каждые три “буквы” ДНК обозначают одну аминокислоту в белке), был впервые продемонстрирован на примере фагов; эксперименты с последними позволили также выяснить, как “включаются” и “выключаются” гены внутри клетки. Даже открытие Джошуа Ледерберга (он обнаружил, что вирусы могут вносить чужеродные гены в инфицированные ими клетки, и это стало одним из ранних подступов к генной терапии) было сделано благодаря фагу, специализирующемуся на бактериях рода Salmonella. Во многом именно эксперименты с вирусами бактерий заложили основы молекулярной генетики.

Кроме того, изучение фагов послужило толчком к революции в молекулярной биологии 1970-х годов. Исследуя иммунные механизмы, с помощью которых бактерии дают отпор фаговым инфекциям, ученые обнаружили класс ферментов, называемых эндонуклеазами рестрикции; их можно “настроить” таким образом, чтобы они разрезали фрагменты искусственно синтезированной ДНК (это было показано в простых экспериментах вне живых объектов). Используя сочетание этих ферментов с другими ферментами, выделенными из инфицированных фагами клеток, исследователи сумели создать и клонировать искусственные молекулы ДНК в лабораторных условиях. Одновременно с этим геномы фагов послужили прекрасной мишенью для только что разработанных технологий секвенирования ДНК. В 1977 году Фред Сенгер и его коллеги успешно определили последовательность всех нуклеотидов ДНК в геноме фага ФX174. Двадцать пять лет спустя тот же фаг снова оказался в центре внимания: он стал первым объектом, чей геном был синтезирован с нуля[54].

Впрочем, бактериофаги – это не просто популярные “подопытные кролики”. Это еще и наиболее многочисленные биологические объекты на планете – и по этому показателю они лидируют с большим отрывом. Фаги в природе так же вездесущи, как свет и почва, и их можно найти в грязи, воде, человеческом кишечнике, горячих источниках, ледяных кернах и практически во всех других местах, где возможна жизнь. Ученые оценивают численность бактериофагов на Земле в 1031 вирусных частиц – десять миллионов триллионов триллионов, или единица с 31 нулем. В одной чайной ложке морской воды в пять раз больше фагов, чем в Нью-Йорке людей. Невероятно, но фагов на планете намного больше, чем бактерий, которые они могут инфицировать; столь же вездесущие, как и микроорганизмы, бактериофаги превышают численность последних на порядок. Они вызывают примерно триллион триллионов инфекций по всему миру каждую секунду, а если брать только океан, то там ежедневно от смертоносного заражения фагами погибает около 40 % всех бактерий[55].

Эти вирусы созданы для убийства: в течение миллиардов лет они эволюционировали, чтобы научиться заражать бактерии с беспощадной эффективностью. Все фаги состоят из прочной белковой наружной оболочки, называемой капсидом, в которую упакован генетический материал. Фаговый капсид может иметь одну из десятков разнообразных форм, и все они спроектированы таким образом, чтобы максимально эффективно защищать геном вируса и успешно переносить его генетический материал в бактериальные клетки, где тот способен размножаться и распространяться. Некоторые фаги имеют изящную икосаэдрическую форму, у других длинный хвост присоединяется к шарообразному капсиду. Нитевидные фаги цилиндрические. Возможно, самые устрашающие из этих вирусов – те, что похожи на инопланетные корабли, с “ногами” для закрепления на поверхности клетки, “головой”, в которой хранится ДНК[56], и “насосами”, впрыскивающими эту ДНК в клетку после того, как фаг закрепится снаружи.

Примеры различных бактериофагов

Методы работы вирусов, как и их внешний вид, разнообразны, но неизменно (и смертоносно) эффективны. Некоторые вирусные геномы упакованы в капсид так плотно, что генетический материал под давлением буквально выстреливает в клетку, словно пробка от шампанского, как только нарушается целостность белковой клеточной оболочки. Сразу после того, как геном вируса попал в клетку, он способен захватить контроль над клеткой-хозяином одним из двух способов. При паразитическом, или лизогенном, жизненном цикле геном вируса внедряется в геном хозяина и в таком виде, никак себя не проявляя, может передаваться из поколения в поколение, ожидая подходящего момента для нападения. Напротив, при инфекционном, или литическом, жизненном цикле геном вируса сразу же захватывает ресурсы клетки-хозяина, заставляя их работать на себя: производить вирусные белки вместо микробных и многократно копировать геном фага до тех пор, пока клетка не лопнет от распирающих ее вирусных частиц, разбросав последние на соседние бактерии. С помощью этого цикла внедрения в клетку, захвата контроля над ней и распространения по ее потомкам или соседям один-единственный фаг может полностью уничтожить целую популяцию бактерий за считанные часы.

Но бактерии не так уж беспомощны в этой старой как мир войне. Точно так же как растения и животные, за миллиарды лет эволюции они выработали впечатляющие стратегии защиты. К моменту нашего разговора с Джилл у бактерий уже были открыты четыре основные защитные системы[57]. В рамках наиболее выдающейся из них бактерии “навешивают” на свой геном уникальные метки, немного меняющие химические свойства ДНК, но не меняющие экспрессию генетической информации. В дополнение к этому бактерии производят ферменты (эндонуклеазы рестрикции), которые разрезают любую ДНК, не несущую таких меток, зачищая клетку ото всех фаговых генов, проникших под ее оболочку. Также бактерии способны попросту заблокировать фаговой ДНК путь внутрь себя – либо заделывая отверстия, проделанные этими вирусами, в результате чего последние не могут ввести ДНК в клетку, либо делая неузнаваемыми белки на своей поверхности, к которым в обычных условиях прикрепляются фаги. У бактерий даже развилась способность чувствовать наступающую инфекцию и “совершать самоубийство” до распространения заразы – самоотверженный способ защитить остальные клетки в сообществе.

Литический жизненный цикл бактериофага

Может ли CRISPR быть еще одним механизмом антивирусной защиты? Чем больше я читала о гонке вооружений между бактериями и бактериофагами, тем более вероятным мне казалось существование других, еще не открытых, орудий, которые они используют в борьбе друг с другом.

Более того, узнавая все больше о CRISPR, я начинала понимать, в каком направлении будут двигаться исследования в нашей лаборатории, если мы примем предложение Джилл. Расчеты голландца Рююда Янсена и его коллег[58] – это они в 2002-м предложили аббревиатуру CRISPR – выявили набор генов, которые в бактериальных хромосомах почти всегда примыкали к участкам с CRISPR. Они разительно отличались и от повторяющихся последовательностей, и от спейсеров в CRISPR.

Даже то немногое, что мы тогда знали об этих ассоциированных с CRISPR генах, или cas-генах, подсказывало, что они представляют собой нечто крайне интересное. Сравнение их строения со строением уже известных генов позволило предположить, что cas-гены кодируют специализированные ферменты, в чьи функции может входить разделение двух цепочек двойной спирали ДНК или разрезание молекул РНК либо ДНК, как у эндонуклеаз рестрикции (последние режут только ДНК).

Учитывая, насколько полезным оказалось открытие эндонуклеаз рестрикции для развития технологии рекомбинантных ДНК в 1970-е годы, казалось весьма вероятным, что при более глубоком изучении разных аспектов работы CRISPR мы обнаружим целый клондайк новых ферментов – и эти белки тоже будут иметь значительный биотехнологический потенциал.

Вот так все это и случилось. Я оказалась на крючке.

Учеными, которые занимаются фундаментальными исследованиями, движут азарт, любопытство, интуиция и упорство – но вдобавок к этим возвышенным качествам нам необходима здоровая доза практичности. Это и банальные поиски финансирования, и непрерывное решение вопросов управления. Те из нас, кто руководит собственными лабораториями, вынуждены делегировать другим ученым множество задач, которые мы прекрасно умеем выполнять самостоятельно. Часто это означает, что каждый раз, когда мы приступаем к новому для нас направлению исследований, нам нужно найти подходящего человека, который отвечал бы за этот участок.

По счастью, моя лаборатория в Беркли получала довольно хорошее финансирование, но когда Джилл рассказала мне о CRISPR, никто из моих сотрудников не был достаточно квалифицирован для того, чтобы взять на себя этот новый, непредсказуемый и потенциально рискованный проект. И тут нам повезло: на собеседование на вакансию постдока пришел Блейк Виденхефт. Когда я спросила молодого претендента на вакансию, над чем он хотел бы работать, то, к своему восхищению, получила в ответ встречный вопрос: “А вы слышали когда-нибудь о CRISPR?” Я тут же взяла Виденхефта на работу. Всего несколько месяцев спустя Блейк обжился в Беркли и самозабвенно работал над успешным запуском проекта по изучению CRISPR.

Дружелюбный и располагающий к себе уроженец Монтаны, впитавший вместе с любовью к спортивным играм присущий им дух соперничества, Блейк приехал в Беркли из Бозмена, из Университета штата Монтана, где он получил и высшее образование, и степень доктора философии. В отличие от большинства исследователей, которых мне приходилось брать на работу до него (все они специализировались на биохимии или структурной биологии), Блейк был прирожденным микробиологом. Подобно Джилл, часть своих исследований он проводил в лаборатории, а часть – собирая образцы в полевых условиях. Работа над докторской диссертацией заносила его и в Йеллоустонский национальный парк, и в Россию, на Камчатку, где в кислотной воде горячих источников он обнаружил ранее неизвестные вирусы, способные выживать и сохранять способность к заражению при температурах выше 75 °C. Стало известно, что эти вирусы инфицируют архей – одноклеточные организмы, похожие на бактерии; в геноме почти у каждой археи есть CRISPR. После секвенирования геномов двух выделенных им вирусов Блейк обнаружил, что значительная часть ДНК у них совпадает. Это означало, что у вирусов должен был быть общий предок – несмотря на огромное расстояние, отделяющее Йеллоустон от Камчатки. Геномы вирусов также содержали ответы на вопрос, каким образом они заражают своих хозяев; анализируя конкретные вирусные гены, Блейк вычислил, какой именно фермент, скорее всего, давал вирусам возможность встраивать фрагменты своих геномов в ДНК ничего не подозревающих хозяев.

Именно такого рода “расследование” нам надо было провести в отношении CRISPR – только в обратную сторону. Вместо того чтобы сконцентрироваться на вирусных генах, обеспечивающих инфицирование, нам необходимо было выследить те гены в бактериях, которые препятствуют заражению – и ассоциированы с CRISPR. Или гены, которые, как мы считаем, препятствуют заражению. Мы в то время еще не были уверены, что именно обеспечивает этот эффект – cas-гены или сам CRISPR.

Большая часть наших ранних обсуждений вращалась вокруг привлекательной гипотезы, согласно которой CRISPR и cas-гены представляют собой части одной системы иммунной защиты от вирусов и РНК используется в этой системе для обнаружения последних. Но гипотеза – лишь первый этап любого обстоятельного научного исследования. Так что нам нужно было еще проверить эту гипотезу и собрать сведения, подтверждающие или опровергающие ее.

На встречах с Джилл и несколькими заинтересованными учеными в Национальной лаборатории имени Лоуренса всего в нескольких минутах ходьбы от моего кабинета в Беркли мы с Блейком размышляли, как нам организовать наши эксперименты. Главный вопрос заключался в том, какой модельный организм нам использовать. В качестве одного из вариантов мы рассматривали Sulfolobus solfataricus, архею, которую впервые выделили из воды горячих источников вулкана Сольфатара рядом с Неаполем. Известно было, что ее клетки содержат CRISPR и что их поражают вирусы, обнаруженные Блейком в Йеллоустоне и на Камчатке, – что было удобно, поскольку Блейк был хорошо знаком с этими формами.

Другим “кандидатом” выступала кишечная палочка Escherichia coli, которую часто называют просто E. coli. Наиболее хорошо изученный на данный момент вид бактерий, E. coli подвержена заражению десятками одинаково хорошо изученных фагов, многие из которых можно просто заказать в интернете. (Также E. coli принадлежит честь быть первой бактерией, у которой определили последовательность CRISPR[59].) В дополнение к этому Блейк предложил Pseudomonas aeruginosa, патогенную бактерию, которая, как было известно, устойчива ко многим антибиотикам и несет в себе CRISPR. Мы знали, что сможем манипулировать ДНК P. aeruginosa, используя разнообразные инструменты генной инженерии, и что эту бактерию инфицируют многочисленные фаги (Блейк провел некоторое время в поисках новых фагов Pseudomonas, но не в экзотических местах вроде Йеллоустона, а на местных канализационных очистных сооружениях области залива Сан-Франциско).

Блейк четко дал мне понять, что он хочет сфокусироваться на изучении биохимии и структурной биологии во время работы в моей лаборатории, и ему не терпелось приступить к научной работе в новом направлении. Перед исследованиями CRISPR он очистил белки семейства Cas, закодированные в геноме P. aeruginosa, и стал проверять их на способность каким-либо образом распознавать или разрушать вирусную ДНК, начав с наиболее распространенного из них – белка Cas1. Затем (это было в 2007 году, примерно в то же время, когда Блейк начал работать в моей лаборатории) Джилл сообщила нам, что скоро будет опубликована важная статья исследователей из Danisco – датской биотехнологической компании и одновременно одного из ведущих мировых производителей пищевых ингредиентов. В своем исследовании они с помощью генетических методов показали, что CRISPR действительно представляет собой бактериальную иммунную систему[60] – хотя спектр ее возможностей на тот момент оставался неизвестным.

Предметом исследования ученых из Danisco была ферментирующая молоко бактерия под названием Streptococcus thermophilus, один из ключевых пробиотиков, используемых в производстве йогурта, сыра моцарелла и бесчисленного множества других молочных продуктов. Человечество поглощает существенно больше миллиарда триллионов клеток живых S. thermophilus в год, и годовая рыночная стоимость культур этих бактерий превышает сорок миллиардов долларов[61]. Вероятно, не стоит удивляться, что эти масштабные инвестиции в молочную промышленность постоянно находятся под угрозой фаговых инфекций – наиболее распространенной причины потерь продукции и неполного брожения. В одной капле сырого молока содержится от десятка до тысячи вирусных частиц, что делает полное уничтожение фагов в нем просто невозможным. Компании, подобные Danisco, пытались бороться с фагами, совершенствуя технологии очистки молока и оборудование фабрик, а также принимая другие меры, – но проблему так и удалось решить[62].

Работая совместно с Филиппом Хорватом и его командой из французского филиала Danisco, группа исследователей под руководством Родольфа Баррангу из американского филиала компании изучала S. thermophilus в попытках найти решение. Родольф и Филипп задумались над тем, что делает некоторые штаммы S. thermophilus более устойчивыми к фаговым инфекциям по сравнению с другими. В молочной промышленности уже начали применять линии мутантных бактерий, менее восприимчивых к бактериофагам, но Родольф и Филипп подозревали, что участки CRISPR в геноме S. thermophilus могут обеспечивать бактерии иммунитетом такого типа, что он окажется даже более сильным, чем случайные мутации у упомянутых штаммов.

Последовательности CRISPR у S. thermophilus, как было известно Родольфу и Филиппу, обладают определенными необычными свойствами, которые можно было бы использовать в экспериментальной работе. Александру Болотину удалось обнаружить некоторые из этих свойств, когда он секвенировал геном S. thermophilus; позднее Болотин сосредоточился на изучении ДНК CRISPR и в конце концов проанализировал более двадцати различных штаммов. В ходе этой работы он заметил, что, хотя повторяющиеся последовательности CRISPR (заштрихованные черным ромбики на рисунке Джилл) всегда были одинаковыми, спейсерные последовательности (пронумерованные квадратики на том же рисунке) у представителей разных штаммов заметно отличались. Более того, многие из этих спейсеров фактически совпадали с участками фаговых геномов, секвенированными незадолго до этого. (Результаты работы Болотина обобщены в одной из трех статей 2005 года, которые Джилл показывала мне в кафе Free Speech Movement.) Главный вывод из статьи Болотина таков: штаммы S. thermophilus, в CRISPR которых было больше таких спейсеров, оказались более устойчивыми к заражению фагами. Хотя было не особенно понятно, какое это имеет значение, казалось, что бактерии неким образом модифицируют свою ДНК в составе CRISPR, имитируя геномы определенных фагов и совершенствуя собственную иммунную систему – если предположить, что CRISPR является таковой, – чтобы эффективнее бороться с этими вирусами.

Основываясь на работе Болотина, Родольф и Филипп спланировали эксперименты для проверки этого предположения. Действительно ли штамм S. thermophilus способен повышать свою устойчивость к конкретному бактериофагу, вставляя себе в область CRISPR новые фрагменты ДНК, совпадающие с последовательностями ДНК этого фага?

В своих опытах исследователи из Danisco сосредоточились на штамме S. thermophilus, который широко используется в молочной промышленности, и на двух вирулентных фагах, выделенных из образцов фабричного йогурта. Основой методики послужили простейшие генетические эксперименты – подобные проводили с начала XX столетия. Ученые заражали популяции бактерий в отдельных пробирках двумя фагами, инкубировали их 24 часа, а затем проверяли, остались ли в этих культурах живые бактерии, высевая их в чашки Петри и оставляя их на ночь расти. Было обнаружено, что, хотя фаги уничтожили более 99,9 % бактерий, девять новых, мутировавших штаммов S. thermophilus, видимо, были устойчивы к заражению фагами.

В этой части исследования Danisco не было ничего принципиально нового, поскольку другие ученые тоже использовали сходные методы для обнаружения резистентных к фагам штаммов S. thermophilus. Но Родольф и Филипп пошли дальше. Они попытались выяснить, что именно на уровне генов обеспечивает бактериям эту наблюдаемую неуязвимость.

У Родольфа и Филиппа была одна догадка по поводу того, какая часть бактериального генома делала мутировавшие штаммы S. thermophilus устойчивыми к заражению вирусами: они подозревали, что за это отвечает CRISPR, и предполагали, что участки CRISPR у девяти новых мутантных штаммов по строению отличаются от таковых у предкового штамма. И действительно: выделив геномную ДНК из каждого мутантного штамма, исследователи обнаружили, что каждая область с CRISPR расширилась за счет вставки новых кусочков ДНК между повторами. Более того, эти новые спейсеры точно повторяли последовательности ДНК фага, к которому конкретный штамм приобрел иммунитет. Особенно примечательным казалось следующее: благодаря физическому встраиванию в область CRISPR бактериальной ДНК новоприобретенная устойчивость наследовалась и могла передаваться всем последующим поколениям при каждом делении.

Исследователи из Danisco обнаружили еще один способ борьбы бактерий с вирусами – их пятый набор вооружения. Как мы теперь знаем, в дополнение к ранее открытым системам защиты у бактерий имеется (в виде CRISPR) удивительно эффективная система противовирусного адаптивного иммунитета, позволяющая “воровать” кусочки ДНК фагов, когда последние заражают бактерии, и использовать их для обеспечения иммунного ответа в будущем. По выражению Блейка, CRISPR работал как “молекулярная карта” профилактических прививок: сохраняя память о предыдущих фаговых инфекциях в форме спейсерных последовательностей ДНК, запрятанных в рядах из повторов и спейсеров, бактерии могли использовать эту информацию для распознавания и разрушения тех же самых фагов во время новых столкновений с ними.

CRISPR: молекулярная карта профилактических прививок

С момента публикации исследования Danisco малопонятная биология CRISPR начала привлекать внимание исследователей. Кроме того, эта статья стала поводом для проведения первой посвященной CRISPR встречи, которая состоялась в Калифорнийском университете в Беркли в 2008 году и была организована Джилл Бэнфилд и Родольфом Баррангу. Однако, как это всегда бывает в науке, исследователи приоткрыли одну дверь, чтобы обнаружить за ней другую. Поскольку для иммунного ответа CRISPR требуется, чтобы последовательности ДНК в вирусном и бактериальном геноме полностью совпадали, было понятно, что эта иммунная система “целится” в генетический материал фагов, чтобы разрушить его, – но как? Какая составляющая клетки наводилась на цель?

Прошло не так уж много времени, и начал вырисовываться ответ и на этот вопрос. Стэн Броунс, постдок из лаборатории Джона ван дер Ооста в Вагенингенском университете в Нидерландах, предоставил убедительное доказательство того, что молекулы РНК задействованы в основанной на CRISPR защите от вирусов[63]. Стэн опирался на более раннее исследование, в ходе которого были обнаружены молекулы РНК, в точности совпадающие с последовательностью ДНК CRISPR в клетках архей различных видов[64] (включая обитающие в вулканах штаммы Sulfolobus, которых изучал Блейк). Это позволило предположить, что РНК может координировать в иммунном ответе стадии распознавания и разрушения фагов. А Стэн, экспериментируя с E. coli, добавил к этим наблюдениям новые сведения, подтвердив, что РНК играет эту роль в основанной на CRISPR системе защиты у совершенно иного микроорганизма, – и это послужило хорошим аргументом в пользу того, что РНК необходима для всех связанных с CRISPR иммунных систем.

Стэн также показал, каким образом в клетке синтезируются молекулы РНК CRISPR. Сначала бактериальная клетка “переводит” весь ряд элементов CRISPR в длинные цепочки РНК, с точностью до буквы совпадающие с последовательностью нуклеотидов в ДНК CRISPR (как мы помним, РНК – молекула-сестра ДНК, состоящая из тех же “букв”, с той только разницей, что “буква” Т в ДНК в РНК заменяется на У). Как только клетка синтезирует эти длинные цепочки РНК на основе CRISPR, фермент с хирургической точностью разрезает их на более короткие РНК одинаковой длины, единственное отличие между которыми – последовательности нуклеотидов в их спейсерах. В ходе этого процесса длинные повторяющиеся последовательности ДНК переводятся в библиотеку из более коротких молекул РНК, каждая из которых содержит одну последовательность, построенную на основе фрагмента генома конкретного фага.

Эти данные указали на ключевую роль, которую РНК CRISPR играет в бактериальной иммунной системе, – и для этой роли РНК идеально подходит. Поскольку РНК химически очень похожа на ДНК, она также может образовывать двойные спирали за счет комплементарных взаимодействий азотистых оснований (которые лежат и в основе знаменитой двойной спирали ДНК)[65]. Подходящие (комплементарные) цепочки РНК могут взаимодействовать друг с другом, формируя двойную спираль РНК – РНК, но и одна цепочка РНК способна соединяться с подходящей одиночной цепочкой ДНК с образованием двойной спирали РНК – ДНК. Эта вариабельность и многообразие последовательностей, обнаруженных в РНК CRISPR, подсказали ученым заманчивую идею. Казалось возможным, что молекулы РНК CRISPR способны “вывести из игры” ДНК и РНК фагов-интервентов, образуя пары с любыми из них, подходящими по последовательности нуклеотидов, и запуская в клетке некий иммунный ответ.

Если РНК в самом деле помогает таким образом “целиться” в генетический материал вирусов, то механизм CRISPR, видимо, действительно похож на механизм РНК-интерференции, который изучали в моей лаборатории, – как и предполагали авторы той статьи, которая и “подсадила” меня на изучение CRISPR! При РНК-интерференции в клетках растений и животных для разрушения вирусов-интервентов образуются двойные спирали РНК – РНК. Вероятно, весьма похожим образом – используя двойные цепочки РНК – РНК, молекулы РНК CRISPR атакуют фаговые РНК в ходе иммунного ответа. Я была очарована открывавшейся здесь дополнительной возможностью: в отличие от РНК-интерференции, молекулы РНК в механизме CRISPR были способны распознавать и комплементарную ДНК – и благодаря этому “CRISPR-оружие” могло атаковать вирусные геномы по двум фронтам сразу.

Вскоре после открытия Стэна два исследователя из Северо-Западного университета – Лучано Марраффини и его наставник Эрик Сонтхаймер (с которым мы были знакомы еще со времен, когда он учился в Йеле) – выяснили, что РНК CRISPR действительно способна управлять процессом разрушения ДНК. Работая с еще одним микроорганизмом под названием Staphylococcus epidermidis – сравнительно безобидной бактерией с поверхности кожи человека (но близкой родственницей опасного и устойчивого к антибиотикам штамма золотистого стафилококка Staphylococcus aureus), Лучано спланировал серию элегантных экспериментов, чтобы доказать, что РНК CRISPR нацеливается на ДНК генетических паразитов-вторженцев[66]. Он также показал, что это наведение на цель, скорее всего, производится за счет комплементарных взаимодействий азотистых оснований – единственного процесса, способного обеспечить специфичность, с которой CRISPR уничтожал свою жертву.

Скорость и тщательность проведения этих исследований захватывали дух. Всего за несколько лет после моего знакомства с механизмом CRISPR его изучение из россыпи интересных, но мало что объясняющих работ переросло во всеобъемлющую единую теорию устройства и работы системы приобретенного (адаптивного) иммунитета микроорганизмов. Эта теория была основана на непрерывно растущем множестве экспериментальных исследований, и, хотя к концу двухтысячных было уже опубликовано немало фундаментальных статей, было очевидно, что всем нам предстоит проделать еще больший объем работы, чтобы действительно разобраться в этой мудреной бактериальной системе защиты.

CRISPR, как мы начинали понимать, имеет гораздо более сложное строение, чем можно вообразить для какого-либо компонента простого одноклеточного организма. В некоторых отношениях открытие этой части иммунной системы бактерий поставило их на одну доску с людьми, так как продемонстрировало, что и те и другие обладают сложными формами клеточного ответа на инфекцию. Правда, никто из нас не знал, какое значение эта бактериальная система защиты может иметь для нашего вида.

Глава 3

Взламывая код

Я помню, как в первый раз вошла в настоящую исследовательскую лабораторию, помню звуки, запахи и ощущение открывающихся возможностей – чувства того, как постепенно раскрываются загадки природы. Это был 1982 год, и после первого курса колледжа я приехала к родителям на Гавайи. Мой отец, профессор английского языка в Гавайском университете, договорился со своим коллегой, профессором биологии Доном Хеммесом, о том, чтобы я смогла провести несколько недель в его лаборатории. Вместе с двумя другими студентами я получила возможность исследовать, как гриб Phytophthora palmivora

Конец ознакомительного фрагмента. Купить полную версию.

Сноски

1

Имеются в виду кухтыли – поплавки для сетей. В наши дни они обычно пластиковые, но раньше выдувались из стекла в виде больших полых шаров (примеч. науч. ред.).

2

Стоит отметить, что это вряд ли возможно. Дело не только в том, что для этого нет достаточно сохранных клеток мамонтов, но и в том, что современные слоны не скрещиваются даже с самыми близкородственными видами. Причины такой избирательности пока неизвестны, но есть вероятность, что виной тому некие генетические барьеры. См. Eleftheria Palkopoulou et al. Genomic history of extinct and living elephantids, Proceedings of the National Academy of Sciences, Mar 2018, 115 (11), E2566 – E2574; DOI:10.1073/pnas.1720554115. – Здесь и далее постраничные сноски, обозначенные астериском (*), если не указано иное, принадлежат переводчику. Сноски, обозначенные цифрами, ведут в конец книги и принадлежат автору.

3

Исследования последних лет говорят о том, что возраст человека разумного как вида больше. Работа 2017 года, в ходе которой изучались остатки Homo sapiens из марокканской пещеры Джебель-Ирхуд, показывает, что нашему виду как минимум 200 тысяч лет. См. Jean-Jacques Hublin et al. New fossils from Jebel Irhoud, Morocco and the pan-African origin of Homo sapiens, Nature, volume 546, pages 289–292 (08 June 2017), DOI: 10.1038/nature22336.

4

Модельные животные – это организмы, строение которых в достаточной степени похоже на строение человека; в ходе экспериментов на модельных животных можно уточнять механизмы развития и протекания болезней человека и определять эффективность лекарств против этих болезней.

5

Этот ген кодирует белок гентингтин. Варианты этой молекулы, которые образуются в клетках с мутациями в гене HTT, вызывают хорею Гентингтона – нарушение умственной деятельности и движений.

6

D. H. McDermott et al., “Chromothriptic Cure of WHIM Syndrome”, Cell 160 (2015): 686–699.

7

WHIM назван по его четырем основным проявлениям: warts (бородавки), hypogammaglobulinemia (гипогаммаглобулинемия, нехватка определенного типа иммуноглобулина), infections (инфекции) и myelokathexis (миелокатексис, дефицит определенных типов белых кровяных телец).

8

P. J. Stephens et al., “Massive Genomic Rearrangement Acquired in a Single Catastrophic Event During Cancer Development”, Cell 144 (2011): 27–40.

9

R. Hirschhorn, “In Vivo Reversion to Normal of Inherited Mutations in Humans”, Journal of Medical Genetics 40 (2003): 721–728.

10

R. Hirschhorn et al., “Somatic Mosaicism for a Newly Identified Splice-Site Mutation in a Patient with Adenosine Deaminase-Deficient Immunodeficiency and Spontaneous Clinical Recovery”, American Journal of Human Genetics 55 (1994): 59–68.

11

B. R. Davis and F. Candotti, “Revertant Somatic Mosaicism in the Wiskott-Aldrich Syndrome”, Immunologic Research 44 (2009): 127–131.

12

E. A. Kvittingen et al., “Self-Induced Correction of the Genetic Defect in Tyrosinemia Type I”, Journal of Clinical Investigation 94 (1994): 1657–1661.

13

K. A. Choate et al., “Mitotic Recombination in Patients with Ichthyosis Causes Reversion of Dominant Mutations in KRT10”, Science 330 (2010): 94–97.

14

J. Lederberg, “’Ome Sweet ’Omics – A Genealogical Treasury of Words”, Scientist, April 2, 2001.

15

Такое соответствие называется комплементарностью, а правило, по которым одно азотистое основание становится напротив другого, называют правилом (или принципом) комплементарности.

16

Здесь не указан еще один процесс – обратная транскрипция. В ходе этого процесса по информации с молекулы РНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) строится молекула ДНК. Самый известный объект, использующий обратную транскрипцию, – вирус иммунодефицита человека. Он входит в довольно крупную группу ретровирусов. В ретровирусах есть только РНК, а ДНК нет. Последняя и образуется в ходе обратной транскрипции, когда эти вирусы попадают в клетки-жертвы.

17

Только в зрелом состоянии; у молодых клеток оно есть, затем утрачивается.

18

Исследование 2018 года опровергает этот тезис: Shiyu Luo et al. Biparental Inheritance of Mitochondrial DNA in Humans, PNAS, December 18, 2018, 115 (51), 13039–13044; published ahead of print November 26, 2018. DOI: 10.1073/pnas.1810946115.

19

Следует уточнить, что хотя избыток аргинина (как и других веществ), безусловно, вредит организму, но без этой аминокислоты нельзя построить белки, так что ее полное отсутствие еще более вредоносно.

20

S. Rogers, “Reflections on Issues Posed by Recombinant DNA Molecule Technology. II”, Annals of the New York Academy of Sciences 265 (1976): 66–70.

21

T. Friedmann and R. Roblin, “Gene Therapy for Human Genetic Disease?”, Science 175 (1972): 949–955.

22

T. Friedmann, “Stanfield Rogers: Insights into Virus Vectors and Failure of an Early Gene Therapy Model”, Molecular Therapy 4 (2001): 285–288.

23

В мае 2016-го Европейская комиссия дала разрешение на производство и использование стримвелиса, однако к марту 2018-го было продано всего пять курсов препарата, что и неудивительно: за год в ЕС выявляется лишь 15 случаев ТКИД с недостаточностью аденозиндезаминазы, при этом стоимость препарата – 594 тысячи евро.

24

Слово “философия” присутствует в этом названии исторически, а сама степень присуждается практически во всех научных областях (примеч. науч. ред.).

25

Постдок, или постдокторант, – ученый, недавно получивший степень доктора философии (Ph. D.) и выполняющий новую, более сложную научную работу. В постдокторантуру набирают по конкурсу и на непродолжительное время, например 2–3 года. В системе научных должностей стран бывшего СССР, перенятой от Союза, аналога постдоков нет. Наиболее близкая к ним категория в российских реалиях – “молодой ученый”, т. е. человек до 35 лет, получивший степень кандидата наук.

26

K. R. Folger et al., “Patterns of Integration of DNA Microinjected into Cultured Mammalian Cells: Evidence for Homologous Recombination Between Injected Plasmid DNA Molecules”, Molecular and Cellular Biology 2 (1982): 1372–1387.

27

Здесь описываются конъюгация и кроссинговер во время первого деления мейоза. В результате этого деления из одной клетки с двойным набором хромосом получается две клетки, каждая с одинарным набором хромосом.

28

Там же.

29

O. Smithies et al., “Insertion of DNA Sequences into the Human Chromosomal Beta-Globin Locus by Homologous Recombination”, Nature 317 (1985): 230–234.

30

K. R. Thomas, K. R. Folger, and M. R. Capecchi, “High Frequency Targeting of Genes to Specific Sites in the Mammalian Genome”, Cell 44 (1986): 419–428.

31

S. L. Mansour, K. R. Thomas, and M. R. Capecchi, “Disruption of the Proto-Oncogene Int-2 in Mouse Embryo-Derived Stem Cells: A General Strategy for Targeting Mutations to Non-Selectable Genes”, Nature 336 (1988): 348–352.

32

J. Lyon and Peter Gorner, Altered Fates: Gene Therapy and the Retooling of Human Life (New York: Norton, 1995), 556.

33

J. W. Szostak et al., “The Double-Strand-Break Repair Model for Recombination”, Cell 33 (1983): 25–35.

34

Sce в названии фермента указывает на организм, из которого данный белок был впервые получен. Это сокращение от Saccharomyces cerevisiae, латинского названия дрожжей.

35

P. Rouet, F. Smih, and M. Jasin, “Introduction of Double-Strand Breaks into the Genome of Mouse Cells by Expression of a Rare-Cutting Endonuclease”, Molecular and Cellular Biology 14 (1994): 8096–8106.

36

Y. G. Kim, J. Cha, and S. Chandrasegaran, “Hybrid Restriction Enzymes: Zinc Finger Fusions to Fok I Cleavage Domain”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93 (1996): 1156–1160.

37

M. Bibikova et al., “Stimulation of Homologous Recombination Through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases”, Molecular and Cellular Biology 21 (2001): 289–297.

38

M. Bibikova et al., “Targeted Chromosomal Cleavage and Mutagenesis in Drosophila Using Zinc-Finger Nucleases”, Genetics 161 (2002): 1169–1175.

39

M. H. Porteus and D. Baltimore, “Chimeric Nucleases Stimulate Gene Targeting in Human Cells”, Science 300 (2003): 763.

40

F. D. Urnov et al., “Highly Efficient Endogenous Human Gene Correction Using Designed Zinc-Finger Nucleases”, Nature 435 (2005): 646–651.

41

S. Chandrasegaran and D. Carroll, “Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering”, Journal of Molecular Biology 428 (2016): 963–989.

42

Если точнее, премию Чеку дали за обнаружение автокаталитических свойств рибозимов – то есть не только их способности к сплайсингу (сшиванию фрагментов) самих себя, но и их способности к разрезанию самих себя.

43

Crisper – выдвижной контейнер в холодильнике для хранения фруктов и овощей.

44

В оригинале – senile felines.

45

G. W. Tyson and J. F. Banfield, “Rapidly Evolving CRISPRs Implicated in Acquired Resistance of Microorganisms to Viruses”, Environmental Microbiology 10 (2008): 200–207.

46

F. J. Mojica et al., “Biological Significance of a Family of Regularly Spaced Repeats in the Genomes of Archaea, Bacteria and Mitochondria”, Molecular Microbiology 36 (2000): 244–246.

47

F. J. Mojica et al., “Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements”, Journal of Molecular Evolution 60 (2005): 174–182; C. Pourcel, G. Salvignol, and G. Vergnaud, “CRISPR Elements in Yersinia pestis Acquire New Repeats by Preferential Uptake of Bacteriophage DNA, and Provide Additional Tools for Evolutionary Studies”, Microbiology 151 (2005): 653–663; A. Bolotin et al., “Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats (CRISPRs) Have Spacers of Extrachromosomal Origin”, Microbiology 151 (2005): 251–261.

48

A. F. Andersson and J. F. Banfield, “Virus Population Dynamics and Acquired Virus Resistance in Natural Microbial Communities”, Science 320 (2008): 1047–1050.

49

K. S. Makarova et al., “A Putative RNA-Interference-Based Immune System in Prokaryotes: Computational Analysis of the Predicted Enzymatic Machinery, Functional Analogies with Eukaryotic RNAi, and Hypothetical Mechanisms of Action”, Biology Direct 1 (2006): 7.

50

D. H. Duckworth, “Who Discovered Bacteriophage?”, Bacteriological Reviews 40 (1976): 793–802.

51

Институт бактериофагов в Тбилиси основал Георгий Григорьевич Элиава в 1923 году. Д’Эрелль приехал туда значительно позже – в 1934-м. Тем не менее в 1923-м двое ученых уже были знакомы.

52

C. Zimmer, A Planet of Viruses. Chicago: University of Chicago Press, 2011. Книга переведена на русский: Карл Циммер. Планета вирусов / Пер. А. Рангулова. Ростов-на-Дону: Феникс, 2012.

53

G. Naik, “To Fight Growing Threat from Germs, Scientists Try Old-fashioned Killer”, Wall Street Journal, January 22, 2016.

54

G. P. C. Salmond and P. C. Fineran, “A Century of the Phage: Past, Present and Future”, Nature Reviews Microbiology 13 (2015): 777–786.

55

F. Rohwer et al., Life in Our Phage World (San Diego: Wholon, 2014).

56

Даудна, вероятнее всего, описывает строение фага лямбда, геном которого представлен молекулой ДНК. Однако бактериофаги вместо ДНК могут содержать и РНК, что в тексте не указано.

57

S. J. Labrie, J. E. Samson, and S. Moineau, “Bacteriophage Resistance Mechanisms”, Nature Reviews Microbiology 8 (2010): 317–327.

58

R. Jansen et al., “Identification of Genes That Are Associated with DNA Repeats in Prokaryotes”, Molecular Microbiology 43 (2002): 1565–1575.

59

Y. Ishino et al., “Nucleotide Sequence of the Iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product”, Journal of Bacteriology 169 (1987): 5429–5433.

60

R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes”, Science 315 (2007): 1709–1712.

61

A. Bolotin et al., “Complete Sequence and Comparative Genome Analysis of the Dairy Bacterium Streptococcus thermophilus”, Nature Biotechnology 22 (2004): 1554–1558.

62

M. B. MarcÓ, S. Moineau, and A. Quiberoni, “Bacteriophages and Dairy Fermentations”, Bacteriophage 2 (2012): 149–158.

63

S. J. J. Brouns et al., “Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes”, Science 321 (2008): 960–964.

64

T.-H. Tang et al., “Identification of Novel Non-Coding RNAs as Potential Antisense Regulators in the Archaeon Sulfolobus solfataricus”, Molecular Microbiology 55 (2005): 469–481.

65

Но это происходит гораздо реже, чем в случае ДНК, из-за разницы в сахарах. В каждом нуклеотиде РНК содержится сахар рибоза, и у нее по сравнению с дезоксирибозой ДНК один атом кислорода “лишний”. Именно он затрудняет образование двойных спиралей РНК.

66

L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA”, Science 322 (2008): 1843–1845.